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酶联免疫检测技术（ELISA）
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罗氏公司（Roche）蛋| 提供商： | 嘉美实验 |
| 服务名称： | 病理学服务：碱性磷酸酶染色实验服务 |
实验技术简介：碱性磷酸酶（AKP）的显示方法最早由Gomeri（1939） 提出，现在这种方法称为Gomeri法。碱性磷酸酶是指磷酸单酯酶Ⅰ，它能在pH8.6~10.0的最适条件下分解磷酸单酯，对于与磷酸相接的醇基没有特 异性，Gomeri法是让该酶在碱性条件下，分解甘油磷酸钠，产生磷酸根。
实验技术原理：在一定条件下，使细胞中的酶作用于酶的底物，使其产物在原地进行 捕捉、沉淀转化为有色产物。细胞组织中的碱性磷酸酶在碱性（PH9.0－9.6）环境下使作用液中的底物（a一磷酸萘酚钠）水解，产生出a萘酚，然后再与 偶氮盐偶联，生成不溶性的耐晒染料（最终产物的颜色因所用偶氮盐的品种不同而有所不同）。
实验操作流程：
1、取材、 固定、包埋、切片；
2、取已粘好烘 干的切片两块，放入二甲苯（一）→二甲苯（二）（各3-4分钟）的染缸中进行脱蜡，再经100%乙醇（一）→100%乙醇（二）→95%乙醇→90%乙醇 →70%乙醇→30%乙醇→水。每级各一分钟，在移切片时，用镊子夹住切片震荡并提起，放下反复几次，在移入下一染缸边缘前稍停留，让溶液滴净后，再入下 一染缸，以免把上一染缸溶液过多带入下一染缸，而影响切片质量；
3、将其中一块切片以蜡笔作一标记（用作对照组切片），放入沸水中煮沸5分钟；
4、将两块切片均放入AKP作用液中孵育30-60分钟，作用液要事先预热到37°C，水浴中进行；
5、取出切片在蒸馏水中洗涤；
6、放入硝酸钴溶液2-3分钟；
7、蒸馏水冲洗干净，否则切片易被污染，影响定位；
8、切片浸入硫化铵中2-3分钟；
9、蒸馏水冲洗干净；
10、经各级酒精脱水。即30%乙醇→70%乙醇→90%乙醇→950%乙醇→100%乙醇（二）→100%乙醇（一），各级一分钟。
在显微镜下观察，细胞中有黑色沉淀存在的地方，就表明有酶的存在。煮沸的对照切片无黑色沉淀。
实验注意事项：
客户提供：
1、组织样品：新鲜组织放入液氮或-80度保存，组织不少于100mg；
2、培养细胞：通过细胞计数取不少于2×106个细胞于EP管，加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂，混匀后保存于冰箱（-80℃，避免反复冻融）；
3、血液细胞标本：以抗凝管保存血样或以淋巴细胞分离液分离细胞后加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂，保存（-80℃可长期保存，避免反复冻融）；
4、血清或细胞培养液标本：离心去掉杂质后取上清入EP管，保存（4℃可保存15-20天，-80℃可长期保存，避免反复冻融）；
5、石蜡切片，冰冻切片以及细胞爬片，涂片等。
6、样本运输：可选择以下任何一种方式寄送标本
组织样本、细胞样本以干冰运输或加入蛋白保护剂后，加冰袋寄送；
细胞样本也可直接寄送培养瓶（密封保证不污染、培养液不漏出）；
血清或上清液直接加冰袋寄送（送视路程远近2-3天可到达）。
交付标准：
1、图片；
2、完整项目报告（材料、试剂、仪器、方法、数据分析、实验结果）。
其他：
1、色时间根据具体情况分析,在显微镜下观察,从几十秒到几分钟不等,主要是估计颜色不再加深。
2、取材要新鲜，以免降低血管内皮碱性磷酸酶的活性。
Tel：010-57425721/57425722 Fax：010-80780672
E-mail：lab-manager@jiamay.com
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