分子生物学：探针合成实验服务

实验技术简介：核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否，可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链，可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况，可分为均匀标记和末端标记探针。

一、双链DNA探针及其标记方法
分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。
双链DNA探针的合成主要有下列两种: RNA的体外转录法和随机引物合成法。
1. RNA的体外转录法：
   体外转录法标记RNA探针可用商品化转录质粒来制备。这些质粒中应该包括SP6、T3或T7 RNA聚合酶的RNA启动位点，而这些启动位点则与多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）相邻。例如，Promega公司提供的pGEM-1、pGEM-2、pGEM-3、pGEM-4、pSP65、pSP70、 pSP72等质粒为为我们带来了方面的转录系统，可从单一构建体产生（+）或（-）方向的RNA探针。这里质粒含有位于pUC19 MCS侧面的SP6和T7 RNA聚合酶启动子。在体内，将SP6或T7 RNA聚合酶加入到含有标记物的三磷酸核苷前体的转录系统中，可允许从任何地方产生多拷贝DNA插入序列的标记RNA探针（即“正义”或“反义”探针）。 使用高浓度（25µmol/l）的35S标记UTP，多达80%的标记UTP可被掺入，每微克模板将产生大约5-10µg比活性为109cpm/µg的标 记RNA探针。为了构建用于探针的克隆，在转录质粒pSP64（Promega公司）的5’→3’方向插入DNA，以便转录体和RNA靶分子互补。应该使 用限制性内切酶，从待扩增插入序列的下游切割，以便DNA线性化。这将保证只有插入序列而非质粒序列被转录。在放射性前体的聚合作用完成后，加入未标记 UTP，并继续保温以保证得到全长的标记探针。这在探针制备中可消除非常短的标记序列，因为，这些短序列可与其他靶分子发生非特异性的杂交结合，增加本底 信号水平。然后制备的探针用无Rnase的DNA模板，并用标准方法进行纯化。利用以下条件，所制备探针的平均长度约为1000~2000bp。

2. 随机引物合成法
      随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，产物平均长度为400-600个核苷酸。
利用随机引物进行反应的优点是：
(1)Klenow片段没有5'→3'外切酶活性，反应稳定，可以获得大量的有效探针。
(2)反应时对模板的要求不严格，用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。
(3)反应产物的比活性较高，可达4×109 cpm/μg探针。
(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。

 
二、单链DNA探针
      用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时，探针序列与被检测序列间有很多错配。而两条探针互补链之间的配对却十分稳定，即形成自身的无效杂交，结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。
单链DNA探针的合成方法主要有下列两种:
    (1) 以M13载体衍生序列为模板，用Klenow片段合成单链探针;
    (2) 以RNA为模板， 用反转录酶合成单链cDNA探针。
1.从M13载体衍生序列合成单链DNA探针
合 成单链DNA探针可将模板序列克隆到噬粒或M13噬菌体载体中，以此为模板，以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物， 在[a-32P]-dNTP的存在下，由Klenow片段作用合成放射标记探针，反应完毕后得到部分双链分子。在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些 长短不一的产物，然后通过变性凝胶电泳(如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)将探针与模板分离开。双链RF型M13 DNA也可用于单链DNA的制备，选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针。
2. 从RNA合成单链cDNA探针
     cDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相应的基因。用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种: (1)用寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用于带Poly(A)的mRNA，并且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3'末端序列。(2) 可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上述缺点，产生比活性较高的探针。但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子，所得探针的序列往往比以克 隆DNA为模板所得的探针复杂得多， 应预先尽量富集mRNA中的目的序列。
      反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后，RNA单链可被迅速地降解成小片段，经Sephadex G-50柱层析即可得到单链探针。

实验注意事项：
客户提供：
1、提供引物及探针设计，包括Taqman探针、分子信标、FRET探针及Simple探针等。

2、提供检测目标的基因序列和具体实验要求
交付标准：
设计并合成高特异性、高灵敏度的引物及检测探针。

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