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Transcription Factors and Regulator
免疫共沉淀
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罗氏公司（Roche）蛋| 提供商： | 嘉美实验 |
| 服务名称： | 分子生物学：基因组 DNA 提取实验服务 |
实验技术简介：DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。
在酸性溶液中，DNA天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。 DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐 溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。
苯酚/氯仿作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态，真核细胞DNA的分离通常是在EDTA及SDS一类去污剂存在下， 用蛋白酶K消化细胞获得。
实验操作流程：
从全血中提取DNA
1、溶血：加300ul的肝素或EDTA二钠抗凝的全血到含RBC Lysis Solution 900ul 的1.5ml EP管, 室温静置1min,期间，轻轻颠倒混匀10次。13000 ~16000 g离心20s。
2、弃上清液，将管底的白色沉淀用枪头吹散，使白细胞在残留的液体中悬浮。
3、加300ul的Cell Lysis Solution于EP管中, 充分混匀。
4、加100ul的Protein Precipitation Solution于EP管中, 充分混匀,13000 ~16000g离心3min.
5、取上清液，加300ul的异丙醇，充分混匀颠倒50次，可见白色絮状沉淀，13000 ~16000 g离心1min 。
6、弃上清液，加入70%的酒精500ul，13000~16000 g离心1min 。
7、弃上清液，加入DNA Hydration Solution 50ul, 充分混匀，65℃5min使DNA 完全溶解。
8、紫外分光光度计测定OD260/280，比值大于1.8即可。
从组织中提取DNA
9、取液氮冷冻的叶片2-3片， 在液氮冷冻下迅速研磨成粉末。
10、将粉末放入到1.5 ml离心管中，然后加入缓冲液“S”750ul, 充分混匀。
11、将离心管置于65℃水浴中1-2小时，水浴过程中温和混匀几次。
12、取出离心管, 每管加入等体积的酚－氯仿(V/V=1:1)溶液600-800ul，混匀后离心，10000rpm, 10分钟。
13、上清液移入另一离心管中，加入等体积的氯仿，混匀后，10000rpm, 6分钟。
14、将上清液移入另一离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，静置一段时间，然后用枪头勾出DNA,并用70％乙醇冲洗2次。
15、勾出的DNA，真空干燥后将其溶于500ul 1×TE中。
16、加入3ul RNA 酶溶液，37℃保温1 小时。
17、加入等体积的酚-氯仿溶液, 轻轻混匀后, 10000rpm离心6分钟。
18、取上清液，加入等体积的氯仿，轻轻混匀后，10000rpm离心6分钟。
19、取上清液，入1/10体积3M醋酸钠，混匀后，加入2倍体积冷的无水乙醇（或95％乙醇）。
20、轻轻混匀静置一会儿后，用枪头勾出DNA, 用70％乙醇冲洗2次后，真空干燥。
21、依所提DNA量加入20-50ul的1×TE溶解DNA。
22、测定DNA 的浓度，取少量样品跑电泳, Agarose 胶的浓度为0.8%。
23、样品在4℃下保存备用。
实验注意事项：
客户提供：
1、细菌、细胞样品需新鲜培养；动物组织、植物组织等样品取样后需液氮速冻。
2、用于提取基因组DNA的血液样品在4℃下可保存一周，-20℃下可保存1个月。
3、实验样品最好使用干冰运输。
交付标准：
结果提供基因组DNA、完整实验报告（电泳照片、OD值测定结果等）
Tel：010-57425721/57425722 Fax：010-80780672
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