提供商: | 嘉美实验 |
服务名称: | 分子生物学:慢病毒载体的 miRNA 载体构建实验服务 |
实验技术简介:miRNA是一种21-25nt长的单链小分子RNA, 是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成,miRNA具有高度的保守性、时序性和组织特异性.而且这种特异 性和时序性,决定了组织和细胞的功能特异性,表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用,因此miRNA的研究受到了生物学家的广泛关 注。
实验操作流程:
1、慢病毒过表达质粒载体的构建
设计上下游特异性扩增引物,同时引入酶切位点,PCR(采用高保真KOD酶,3K内突变率为0%)从模板中(CDNA质粒或者文库)调取目的基因CDS区(coding sequence)连入T载体。将CDS区从T载体上切下,装入慢病毒过表达质粒载体。
2、慢病毒干扰质粒载体的构建
合成miRNA对应的DNA颈环结构,退火后连入慢病毒干扰质粒载体
3、慢病毒载体的包装与浓缩纯化
制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体分别进行高纯度无内抽提,共转染293T细胞,转染后6 h 更换为完全培养基,培养24和48h后,分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
实验注意事项:
客户提供:
1、目的基因的序列信息;
2、病毒载体要求及选择。
交付标准:
1、2×106 TU病毒颗粒;
2、并附上重组成功的酶切鉴定结果及对目的基因的PCR鉴定结果;
3、完整项目报告(材料、试剂、仪器、方法、数据分析、实验结果)。
Tel:010-57425721/57425722 Fax:010-80780672
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