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罗氏公司（Roche）蛋| 提供商： | 嘉美实验 |
| 服务名称： | 分子生物学：慢病毒载体的 miRNA 载体构建实验服务 |
实验技术简介：miRNA是一种21－25nt长的单链小分子RNA, 是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，miRNA具有高度的保守性、时序性和组织特异性.而且这种特异 性和时序性，决定了组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用，因此miRNA的研究受到了生物学家的广泛关 注。
实验操作流程：
1、慢病毒过表达质粒载体的构建
设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。
2、慢病毒干扰质粒载体的构建
合成miRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体
3、慢病毒载体的包装与浓缩纯化
制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
实验注意事项：
客户提供：
1、目的基因的序列信息；
2、病毒载体要求及选择。
交付标准：
1、2×106 TU病毒颗粒；
2、并附上重组成功的酶切鉴定结果及对目的基因的PCR鉴定结果；
3、完整项目报告（材料、试剂、仪器、方法、数据分析、实验结果）。
Tel：010-57425721/57425722 Fax：010-80780672
E-mail：lab-manager@jiamay.com
Web：www.jiamay.com.cn www。jiamay.com
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