酶活性检测：端粒酶活性检测实验服务

实验技术简介：近几年来端粒酶由于与长寿、癌症等的研究相关联而备受关注。 端粒酶是合成染色体末端的端粒的酶。端粒(telomere)是真核细胞染色体的天然末端，由上千个6 碱基重复序列(TTAGGG)组成，是细胞必需的遗传组分，它的作用是维持端粒有足够的长度，保证基因信息在复制过程中的准确性，以防止染色体末端遗传信 息的丢失。在正常情况下，每个细胞分裂周期都会使端粒变的越来越短，当端粒短到一定程度时就会发出信号，细胞停止分裂。

端粒酶由RNA 和蛋白质亚基组成，是基本的核蛋白逆转录酶，在细胞染色体复制过程中，能够以自身RNA 为模板，在染色体3’末端合成重复序列，维持端粒的长度。端粒酶在正常体细胞中的活性被抑制，但是大量的资料表明在一些恶性肿瘤中的表达高达85%。由于 端粒酶特异地表达于各种肿瘤细胞，并且是大多数肿瘤细胞持续分裂所必需的。因此，端粒酶活性是诊断多数恶性肿瘤、判断愈后的良好指标。

实验技术原理：
利用端粒酶在体外可以以其自身RNA 的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6 个碱基的重复序列的特性，采用PCR 方法扩增此重复序列，并进而用聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳显示6 个碱基差异的梯带。1994 年Kim 建立的TRAP 法，其主要原理如下：首先合成一个18nt 的TS 做上游引物，端粒酶结合TS 末端的GTT 并合成AGGGTTAG，然后每经过一次转位合成一个ggttag 的6 碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入CX 做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。

PCR端粒酶活性检测试剂盒基于同样的的原理，利用银染技术检测端粒酶的活性。阳性结果在凝胶电泳上显示相隔6bp 的梯状条带，条带的多、寡、深或浅表示端粒酶活性的大小。TRAP-银染法保留了传统TRAP 法灵敏度高、特异性强等优点，避免了同位素的放射污染。同时，还增设了内标准物，提供阳性对照品，优化了引物设计，使PCR效果进一步提高，使之能够高灵 敏的检测到细胞和组织提取物中端粒酶的活性。

实验操作流程：
1、端粒酶的提取
⑴ 手术后取下的活组织，立即保存在液氮之中；
⑵ 40～100mg 冷冻(-80%℃)组织用无菌眼科手术剪尽量剪碎，研磨器研磨，加入40 ul Lysis buffer(使用前每ml Lysis buffer 加入2μlβ-巯基乙醇);或1～2×106 沉淀细胞直接加入40μl 预冷的Lysis buffer，悬浮细胞，涡旋振荡10s, 置冰浴中30min，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共5-6 次；

备注：为了获取比较理想的端粒酶提取液，建议在一些干硬组织中适当加入Washbuffer。
⑶ 4℃离心(13000rpm,20min)。
⑷ 移取上清，分装3-4 管，每管约20μl。其中一份样品用于蛋白质浓度定量，其余迅速冷冻，-80℃保存。
2、PCR 扩增
3、10%聚丙烯酰胺凝胶电泳
4、银染(
⑴ 将凝胶置于10%醋酸固定30min 后用蒸馏水漂洗3 次，每次5min;
⑵ 将凝胶置于0.2g/L 硫代硫酸钠浸泡1min, 然后用蒸馏水漂洗3 次，每次30s;
⑶ 将凝胶置于硝酸银染液中浸泡30min, 然后用蒸馏水漂洗30s;
⑷ 将凝胶置于显影液中显色10min 左右直到全部条带显色清晰为止;
⑸ 将凝胶置于5%醋酸中浸泡终止反应。
⑹ 选择适当时机照相。
备注：
① 硝酸银染液：0.2g AgON3、25ul 37%甲醛，定容至100ml。

② 显色液：3g Na2CO3、25ul 37%甲醛、0.4mg 硫代硫酸钠，定容至100ml。
5、使用凝胶分析软件进行结果分析

实验注意事项：
客户提供：
1、组织样品：新鲜组织放入液氮或-80度保存，组织不少于100mg；
2、培养细胞：通过细胞计数取不少于2×10⁶个细胞于EP管，加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂，混匀后保存于冰箱（-80℃，避免反复冻融）；
3、血液细胞标本：以抗凝管保存血样或以淋巴细胞分离液分离细胞后加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂，保存（-80℃可长期保存，避免反复冻融）；
4、血清或细胞培养液标本：离心去掉杂质后取上清入EP管，保存（4℃可保存15-20天，-80℃可长期保存，避免反复冻融）；
5、样本运输：可选择以下任何一种方式寄送标本
组织样本、细胞样本以干冰运输或加入蛋白保护剂后，加冰袋寄送；
细胞样本也可直接寄送培养瓶（密封保证不污染、培养液不漏出）；
血清或上清液直接加冰袋寄送（送视路程远近2-3天可到达）。
交付标准：
1、图片；

2、完整项目报告（材料、试剂、仪器、方法、数据分析、实验结果）
其他：
1、细胞提取物中没有足够的端粒酶：在冰浴条件下制备细胞和组织提取物，尽量缩短制备时间，适当用较高浓度的端粒酶样品，减少不必要的操作。
2、端粒酶的反应时间不够：保证反应时间不少于20min。
3、所有样品和阴性对照都成阳性：PCR 残余污染。PCR 反应的每一组分勿重复使用保证使用洁净的PCR 管和PCR 试管架
4、同一种组织会有不同的端粒酶的表达活性：动物本身就有种内差，每个个体的端粒酶的表达活性情况也会不一样。 同一个体的不同组织(如睾丸/骨髓)端粒酶的表达也不一定相同。同一个体的同一组织的不同部位端粒酶的表达情况也不一定相同。
5、肿瘤组织中没有出现预期的端粒酶条带：肿瘤组织中端粒酶的表达达85%，也有部分肿瘤组织中没有端粒酶的表达，所以极少数肿瘤组织中有可能没有出现端粒酶的条带。
6、阳性对照中看不到梯度：因反复冻融会导致阳性对照中的端粒酶失活，所以应注意低温操作。
7、阴性对照里有梯度条带出现：PCR 产物、buffer A 及反应试剂等交叉污染，请将PCR 扩增产物提取区域和反应试剂配制区域分开。另外请经常使用手套。电泳上样时的交叉污染，每次上样时更换枪头。
8、由于热处理、RNase 处理不充分而引起梯度条带消失：将要使用的枪头用DEPC 水浸泡至少24 小时，再进行高压灭菌，烤干;提取样品所用的玻璃制品、陶瓷品及手术器械等经烤箱170℃烘烤5 个小时。
9、端粒酶活性不高：改善端粒酶反应条件，适当增加端粒酶反应时间，适当增加PCR 循环数(但要避免达到平台效应，使非特异性扩增大量出现)，避免buffer A 的恶化，尽量减少端粒酶样品反复冻融。实验操作的指导原则是快速，低温。

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