Dynabeads® M-280链霉亲和素磁珠

Dynabeads® M-280 Streptavidin链霉亲和素磁珠

简单介绍：

产品描述：链亲和素包被的Dynabeads ®为分离生物素抗体，核酸或其他生物素配体和靶分子的最佳选择。这种链亲和素-生物素的高亲和力 ( Kd值10-15 )在分子上有着广阔的应用。磁珠是单层而不是多层的链亲和素重组体。这对自由生物素或生物素配体和靶分子而言，在空间排列有着绝大多数的生物素结合位点。没有过量的物理吸附链亲和素确保了只有微量的链亲和素会遗漏。批次间变化小，结果重复性好。

优点和特性：•直接快速捕获任何生物素靶分子

•灵活的固相操作和优化的液相反应动力学

•磁性操作易于适应自动化平台

•批次重复性高，结果可靠一致

本产品包含：共价偶联了链亲和素重组体的 Dynabeads® (2.8 µm) ，保存在PBS中， pH 7.4，0.1 BSA和0.02 NaN3 作防腐剂。

应用：过去15年中,，Dynabeads® M-280 Streptavidin已有达到了前所未有的广泛应用。主要应用在制备单链DNA模板，分离RNA和DNA结合蛋白，固定长链DNA片段，纯化测序产品，特效捕获核酸。Dynabeads®被全世界的IVD仪器使用了不少于25,000例。

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浓度：10mg/ml

储存条件：2-8℃

结合能力：磁珠的结合能力由DNA片段长度决定。 1mg磁珠结合700-1,000 pmoles自由生物素，200 pmoles生物素标记的核苷酸(单链) ，5 - 10µg生物素标记抗体和5 pmoles的2 - 4 kb双链DNA片段。结合大片段DNA (>2kb)，我们推荐使用Dynabeads® kilobaseBINDER试剂盒(货号 601.01 ) 。

全文说明书：

英文名称：Dynabeads® M-280 Streptavidin中文名称：Dynabeads链霉亲和素磁珠M-280试剂盒

货号：112-05D（2ml），112-06D（10ml），602-10D（10ml）

For research use only（研究用）

INDEX

1. PRODUCT DESCRIPTION  产品介绍

2. PRINCIPLE  原理

3. INSTRUCTIONS FOR USE 用法说明

3.1 Preparation of Dynabeads M-280 Streptavidin              磁珠准备

3.2 Immobilization Procedures        固定程序

3.3 Release of Immobilized Biotinylated Molecules    固定后生物素化分子的释放

3.4 Automated Protocols                自动操作规程

4. GENERAL INFORMATION  常规信息

4.1 Product Characteristics             产品特性

4.2 Binding Capacity    结合能力

4.3 Biotinylation of Molecules         生物素化分子

4.4 References             参考文献（略）

4.5 Additional Material Needed       其他必备材料

4.6 Recommended Buffers/Solutions      推荐缓冲液/液体

4.7 Other Steptavidin-Coupled Dynabeads       其他种类链霉亲和素相耦连Dyna磁珠的介绍

4.8 Storage & Stability  储存条件及稳定性

4.9 Warnings & Limitations    警告及局限性

4.10 Trademarks & Patents    商标及专利（略）

4.11Warranty                质量保证（略）

1. 产品介绍：本公司M-280链霉亲和素磁珠是统一规格、超顺磁性的聚***乙烯磁珠，其表面被覆单层链霉亲和素，链霉亲和素以共价方式黏附于磁珠表面。本公司提供的磁珠产品以悬浮液方式包装，每ml含10mg-Dyna磁珠，磁珠的贮存液是pH=7.4的***酸盐缓冲液，其中含0.1BSA和0.02叠氮钠——作为防腐剂。

本公司提供不同包装规格的产品：No. 112.05 产品是2ml 包装；No. 112.06产品是10ml包装；No. 602.10是100ml包装。

2.原理：链霉亲和素偶联的磁珠作为固相基质，可简便快捷、有效地与许多生物素化复合物结合，如：小分子，肽类，蛋白，抗体，糖类，凝集素，寡合核苷酸，DNA/RNA等。应用本公司的磁珠收集器（Dynal MPC），可高效率地收集磁珠、及随后实验操作靶分子。磁珠捕获、漂洗及检测等流程易于操作及体系优化。单层链霉亲和素以共价方式被覆在磁珠表面，确保较低的可忽略不计的失耦连率。磁珠上链霉亲和素的吸附无过多现象，能确保在您实验应用或检测中，不同批次试剂的变动小、结果重复性好。

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3. INSTRUCTIONS FOR USE          使用说明书

3.1. Preparation of Dynabeads M-280      Streptavidin                 M-280磁珠的准备

使用前，需要洗去磁珠上防腐剂。应用磁珠收集器（Dynal MPC）可简化清洗程序。

1、轻轻摇晃装磁珠小瓶，悬浮磁珠，获得均匀一致的悬浮液。

2、根据需要，转移适当量磁珠悬浮液到备用管中。

3、将管子放在磁力架1-2分，在分离过程，不要将管子从磁力架上拿下来。

4、用移液器将管中上清移去（此时管置于磁力架上），避免移液器枪头触及管内壁（因磁珠附着于管内壁）

5、从磁力架上取下管子，根据您的特殊用途加入合适缓冲液，让缓冲液沿管内壁（磁珠积聚处）留下并轻轻悬浮，缓冲液用量与磁珠悬浮液等体积。

6、重复洗一次（步骤3－5），然后放入适当体积缓冲液配制磁珠工作液。

3.1.A. Preparation for RNA Manipulations         RNA操作的准备

Dynal链霉亲和素磁珠液M-280不是去RNA酶的。溶液A和B成分见4.6节。

7、向溶液A和溶液B加入DEPC，使其终浓度达0.1，用力震荡。

8、室温放置1小时，高压灭菌。

9、用等体积溶液A洗磁珠两次，1－3分钟

10、用等体积B洗磁珠一次。

11、用溶液B悬浮磁珠。

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3.2. Immobilization Procedures                固定程序

Dynal链霉亲和素磁珠M-280为多种分子水平操作、亲和提纯及各种生物检测提供了一个很好的载体。捕获靶分子有直接法或间接法。间接方法中，首先向样品中加入生物素化配体，其与特异性靶分子结合形成复合物。此复合物与用于捕获的磁珠共孵育。鉴于生物素与链霉亲和素的强亲和力、快速结合活力，间接捕获法可应用于配体－靶分子结合动力低或亲和力弱的实验中，以使非特异性结合最小化。此法还可应用于配体浓度低、配体－靶分子结合需要最适空间构象及真正液相动力学的实验中。

3.2. A. Nucleic Acids:            核酸

1、用B&W缓冲液将磁珠洗一次（见3.1和4.6节）。

2、在离心管或微滴定孔中取整数体积洗磁珠，最后一遍洗后去除缓冲液。

3、用B&W缓冲液悬浮磁珠，使终浓度为5ug/ul，或实验应用的适宜浓度。

4、加等体积的生物素化DNA/RNA, B&W缓冲液中NaC 浓度是2M，在混合物中NaC I浓度应为1M。DNA/RNA所需量依赖于具体应用所需。

5、室温下放置，轻轻旋转或时而轻敲离心管混合。孵育时间依赖结合的核酸长度：短的寡核苷酸（小于30个碱基）需要的孵育时间不超过10分钟。30碱基至1kb的孵育时间为15分钟。

6、磁珠此时被覆了生物素化的DNA/RNA片段，用磁力架分离磁珠。将离心管放在磁力架上1到2分钟。

7、用1倍B&W缓冲液洗2-3次，用磁力架吸附磁珠以利于洗涤（在4.6节中推荐的是2倍浓缩液）。

8、悬浮磁珠，稀释至所需浓度。此时磁珠已结合了经固定化后的DNA/RNA片段，应用低盐浓度缓冲液悬浮磁珠，以利于下面的操作。

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注意： 若需固定的生物素化DNA片段长度在1kb以上，我们推荐试剂盒Dynabeads® kilobaseBINDER™ Kit (Prod.No. 601.01).此试剂盒提供独特的连接液，使每mg链霉亲和素磁珠Dynabeads M-280与70pmoles浓度长4kb的生物素化DNA片段固化；与80pmoles 10kb片段固化。

3.2 B.抗体

1、计算磁珠和生物素化抗体所需用量。每mg链霉亲和素磁珠M-280 需要大约5-10 µg 抗体。假定抗体100％生物素化，此时链霉亲和素饱和。

2、将磁珠和生物素化抗体在室温下孵育30分钟，缓慢震荡。

3、此时磁珠被覆了生物素化抗体，将离心管置于磁力架2-3分钟分离磁珠。

4、用PBS/BSA洗涤磁珠4-5次，用磁力架辅助。

5、悬浮磁珠稀释至所需浓度。

3.2 C  生物素化小分子：链霉亲和磁珠Dynabeads M-280还可用于固定诸如小分子、肽类等生物素化配体。生物素化配体与磁珠结合能力依赖于磁珠与配体之间、及配体与配体之间的空间构型、及电荷相互作用。磁珠表面每个链霉亲和素有3-4个结合位点。每mg磁珠大约加入1000pmoles的生物素化小分子即可达到饱和，充分混合15-30分钟。分子的大小决定实验中其需加入的浓度。在结合过程中，磁珠的浓度应在10-50mg/ml。应用磁力架洗涤已被覆抗体的磁珠3-4次，去除未结合物质。结合缓冲液的盐浓度和PH值依据固化分子类型不同而不同。固化后的分子根据下游实验不同而选择合适的缓冲液。磁珠与固化分子的复合物在共用缓冲液中性能稳定。

3.3 生物素化分子的释放

生物素和链霉亲和素之间化学键的断裂需要严格条件。例如，将复合物置入PH=8.2、含95％甲酰氨的10 mM EDTA中 65°C孵育5分钟或90°C孵育2分钟，超过96生物素化DNA片段均可被特异地分离。另一种方法，可将与磁珠相连的固化靶分子置于0.1SDS中煮沸5分钟。

3.4. Automated Protocols  自动化操作程序

在多种技术平台中，均可自动化应用Dynal磁珠的磁性选择和操作。在网址www.invitrogen.com可查找所需操作流程。

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4. GENERAL INFORMATION    总说明

4.1. Product Characteristics    产品特性

本产品任何匹号的磁珠均具有典型特征：

直径：2.8  µm;

表面积：4-8 m2/g；

密度：1.4 g/cm3。

本产品中应用的重组链霉亲和素是一种分子量约为52kDa的蛋白质，（1）由四个相同亚基组成，每个亚基均有一个可与生物素结合的高亲和力位点。链霉亲和素的结合特性与亲和素相同。有较少的非特异性结合。（2）链霉亲和素与生物素间结合快速且牢固，一旦结合后不受pH、温度、有机溶剂及其他变性剂的影响。若有需要可获分析证明书。在网址www.invitrogen.com可查找所用材料安全记录表。

4.2. Binding Capacity   结合能力

与链霉亲和素耦连的磁珠被覆单层重组链霉亲和素。这种结构在空间上提供了大量生物素结合位点，游离的生物素及生物素化配体均可与之结合。

结合能力与固化的特定靶分子的大小有关。在您的样品中要确保无过量的游离生物素存在，因为游离生物素比大分子量的靶分子结合链霉亲和素快速得多。

核酸结合能力呈片段长度依赖性。用P32标记PCR产物结合磁珠的定量分析中显示，PCR产物长度影响结合能力。500bp长的DNA片段结合能力比1000bp长的片段高2倍。长DNA片段结合能力下降可能由于位阻效应所致。

盐浓度影响生物素化核酸与磁珠的结合能力。生物素化DNA片段（《1kb）最适结合条件：终浓度为1M 的NaCI，25°C，15分钟。

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在您的靶PCR产物溶液中，要确保不含过多的游离生物素化寡核苷酸。在PCR过程中，通过限定生物素化引物的浓度，或者通过超滤法、微透析法或其他清除方法去除游离生物素化引物来确保体系去除游离生物素化引物。

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1毫克链霉亲和素M-280磁珠可结合：

700 pmoles游离生物素；200 pmoles生物素化寡核苷酸；5 - 10 µg生物素化抗体；5 pmoles 长2-4kb的双链DNA片段。

NOTE: 注意

Dynal公司建议每种应用中磁珠的用量应通过滴定法进行优化，因为固化特定分子的大小和生物素化程序均可能影响二者结合能力。

4.3. Biotinylation of Molecules  生物素化分子

生物素化配体与链霉亲和素耦连的磁珠结合。因磁珠的独特磁性、生物素/链霉亲和素结合的稳定高效性，所以对结合后的生物素化复合物的操作简便。利用磁珠磁性进行操作，使缓冲液的更换及其他实验程序简易化。

Dynal公司推荐使用如Pierce 或 Sigma生产的生物素化试剂。针对不同的功能集团（胺类、巯基，羧基，碳水化合物、酪氨酸和组氨酸侧链、胍、胞嘧***碱基）有多种生物素化试剂可采用。根据您的用途特异性选择生物素化试剂，避免靶分子的灭活。

生物素复合物有光敏感性，其光反应无特异性。在一些应用中为降低位阻，采用具有不同取间隔装置的几种生物素化复合物。所用试剂根据用途不同，可以是水溶性或非水溶性。

注意事项：

所有生物素试剂均应包含一个取间隔装置以降低位阻，其长度至少6个碳原子。

样本中游离生物素可降低链霉亲和素耦连磁珠的结合能力。Sephadex®葡聚糖柱可帮您去除样本中游离的生物素。

•为优化结合效率，可用反相HPLC/FPLC法净化生物素化寡核苷酸引物。

•推荐使用5’端生物素化的引物，3’端保持游离以利于延伸。

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4.3.A. Biotinylation of Oligonucleotide Primers 生物素化寡核苷酸引物

许多公司均有出售生物素化寡核苷酸。在DNA合成过程中建议在寡核苷酸引物5’端直接结合生物素——生物素***氨化。在合成反应中用生物素***氨化法使5’端生物素化，可不影响标记的寡核苷酸特异性或融解温度。以下介绍的是通过化学结合法完成5’或3’端氨修饰寡核苷酸的生物素化流程。

1.将0.1 µmol氨基修饰核苷酸溶于0.7 ml无菌蒸馏水中（用Aminolink 2™试剂可合成5’ 氨基修饰寡核核苷酸。）

2. 加入0.1 ml 的1.0 M NaHCO3/Na2CO3 缓冲液，pH值为 9.0.

3. 用一种酯类试剂（Biotin-X-NHS-Ester）让生物素贴附在氨基上。将10mg/ml 的Biotin-X-NHS-Ester溶液溶于二甲基甲酰氨中。取配好的此溶液0.2 ml加入反应混合物中。

4.室温放置2小时。

5. 用NAP™-10 柱法去除痕量游离Biotin-X-NHSEster。

6. 根据厂家说明书用反相HPLC法纯化生物素化寡核苷酸。

4.3.B. Purification of Biotinylated Primers    生物素化引物的纯化

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因为游离生物素可占据磁珠上的结合位点从而降低生物素化PCR产物的结合能力，所以将游离生物素从生物素化寡核苷酸中分离出是很重要的，可首选FPLC法或反相HPLC。此纯化步骤也能确保全长脱氧寡核苷酸标记水平接近100％。

用生物素***氨化法进行引物生物素化时，引物生物素化率可达70－75％，即还有25－30％的引物没有被生物素化。用反相HPLC或FPLC法对生物素化引物进行回收纯化是必要的。

4.3.C. Biotinylation of Larger DNA Fragments    DNA长片段的生物素化

I.用生物素化引物进行PCR，进行末端标记。

II. 生物素dUTP 标签酶催化结合反应：生物素化dUTP经酶催化与双链DNA结合，可通过KlenowDNA聚合酶催化、缺口翻译或混合引物标记在双链DNA末端进行标记。

III.***酸生物素化。生物素的***酸激活形式经UV光照射可随机的与DNA片段结合。

4.3.D. Biotinylation Using Cleavable Reagents 分离试剂法进行生物素化

I. 生物素化dUTP类似物与可分离连接物结合：生物素与某一含二硫键的连接物结合，二硫键较易被DTT打开使得DNA片段分离出。此试剂通过酶催化与DNA片段连接，如经末端标记法、缺口翻译法或混合引物标记法。

II. NHS生物素的胍类似物化学结合法：在pH改变时，亚氨生物素即可与结合的核酸分离。链霉亲和素/亚氨生物素复合物在pH 4.0时分离。在pH 9.5或再大点，亚氨生物素与链霉亲和素磁珠M-280紧密结合。释放的亚氨生物素还可被再固化到磁珠上。

4.3.E. Other Nucleic Acid Biotinylation Alternatives 其他核酸生物素化方法

氨基修饰的核酸片段可用biotin-X-NHS Ester试剂进行化学法生物素化。Photobiotin®标记系统可将生物素引入已合成的寡核苷酸。生物素可随机与寡核苷酸结合。

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大多数情况下，此生物素化程序适用于DNA及RNA。合成的RNA片段可被***酸生物素化。如DNA一样，在UV光照射下生物素的***酸激活形式可随机与RNA片段结合。

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4.3.F. Biotinylation of Proteins  蛋白质生物素化

用酯类试剂biotin-X-NHS Ester将蛋白质生物素化。NHS-生物素包含一个可解离的二硫键，使目的蛋白质容易从生物素/链霉亲和素复合物中分离出。

Example of antibody (Ab) biotinylation:     抗体生物素化样例：

1．计算单位体积所纯化的抗体分子数量。

2.将10摩尔的生物素化试剂Biotin-X-NHS Ester (分子量 = 454.5)加入10 µl DMSO中溶解，然后向抗体溶液中加入此溶液。

3.加入1.0 M NaHCO3溶液，使终浓度达0.1 M ，且pH为 8.0。必要时调整pH至8.0。

4. 4°C孵育过夜。

5.胶过滤，如Biogel® P-30在含终浓度为0.1 M NaN3的PBS中。

6.计算抗体终浓度，4°C保存。保存时要加入BSA，BSA终浓度为0.1或低些。

4.4 References  参考文献(略)

4.5. Additional material needed  其他必备品

磁性装置（Dynal MPC®磁性颗粒收集器），手动/自动操作均需要

混匀装置

测试管和移液器

缓冲液/溶液（见4.6节）

生物素化配体/探针

4.6. Recommended buffers/solutions   推荐用缓冲液/溶液

                  所用试剂均为分析纯

B&W Buffer:                                                                     B&W缓冲液

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以下为2倍浓缩结合/洗涤缓冲液配方：

10 mM Tris-HCI (pH 7.5)

1 mM EDTA

2.0 M NaCI

溶液A:：DEPC处理的0.1 M NaOH；DEPC处理的0.05 M NaCl

溶液B：DEPC处理的0.1 M NaCI

For DEPC-treatment, see section 3.1.A. above.

DEPC处理请参见3.1节。

4.7. Other Streptavidin-Coupled Dynabeads              Dynal其他链霉亲和素耦连磁珠

Prod. No. Product Description                产品号   产品描述

653.05/06/07 Dynabeads® M-270 Streptavidin   Based on hydrophilic 2.8 µm beads with negative charge.

链霉亲和素磁珠M-270：直径2.8µm，带负电荷，亲水磁珠。

601.01 Dynabeads® kilobaseBINDER™ Kit for immobilisation of long biotinylated DNA fragments.

用于固定生物素化DNA长片段。

650.01/02/03 Dynabeads® MyOne™ Streptavidin C1 Based on hydrophilic 1 µm beads with negative charge

直径1µm，带负电荷，亲水磁珠。

656.01/02/03 Dynabeads® MyOne™ Streptavidin T1 Based on hydrophobic 1 µm beads.

直径1µm，亲水磁珠。

4.8. Storage & Stability     贮存与稳定性

密闭2-8°C保存，在有效期内磁珠稳定，有效期标注在标签上。

磁珠小瓶要竖直存放，以保证磁珠呈悬浮液，磁珠烘干会导致其性能下降。此产品不能冷冻。

用前要充分悬浮磁珠

链霉亲和素磁珠悬浮液未经核糖核酸酶灭活。

要防止细菌污染磁珠。

Dynal的磁粒收集器要远离磁带、计算机磁盘或其他的磁性存储系统，因强的磁场会损坏它们。

4.9. Warnings & Limitations   警告和限制

本产品仅用于研究，不用于人类诊断或治疗程序。

本产品含0.02叠氮化钠 (NaN3)作为防腐剂。吞入叠氮化钠可中毒。避免经口吸入。叠氮化钠与铅和铜反应可生成高效能***－金属叠氮化物。若处理过程需流经铅制排水管道，要用大量水冲洗以避免叠氮化物的阻塞。

未经Dynal Biotech公司同意，本产品不得重包装再次销售。

4.10. Trademarks & Patents            商标及专利（略）

4.11. Warranty              保证

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