谷胱甘肽过氧化物酶测试盒

 
产品说明
谷胱甘肽过氧化物酶(GPX, EC1.11.1.9) 是一类过氧化物酶，其生物活性主要是保护机体免受氧化损伤。 它通过去除细胞内的自由过氧化物来防止细胞脂质膜被氧化。 谷胱甘肽过氧化物酶催化下面与谷胱甘肽还原酶（GR）的反应。
简单、直接以及高通量测定GPX活性方法应用广泛。BioAssay Systems公司GPX活性测试方法基于直接测量酶耦合反应中NADPH的消耗，其340nm处吸光值的降低与样品中GPX酶的活性成正比。
产品特点
灵敏、准确：用10µL样品，线性检测范围：12-300 U/L GPX活性。
产品用途
直接检测：检测生物样品中GPX的活性。
药物开发：药物对GPX活性的影响。
试剂盒组成
缓冲液： 25 mL
GR酶： 1 mL
谷胱甘肽: 240 mL  
NADPH：40 mL
H2O2：100 mL
标准品：100 mL
阳性对照：9 mL GPX 谷胱甘肽过氧化物酶
储藏条件：该试剂盒用冰袋运输。所有组份在-20°C下保存。保质期3个月。
预防措施：本产品仅供研究用。使用过程中严格遵循实验安全措施。
样品制备
所有样品必须透明、不浑浊、无沉淀。液体样品如非溶血血清、血浆可直接检测。组织(10mg)和细胞(106)：在200 mL冰冷的1 x PBS中匀浆，然后在转速为14,000转/分的离心机中离心10min。取上清液进行检测。如果没有立刻检测，将上清液冷冻在-80°C(这样可保质一个月)。
检测步骤
1、试剂的制备：将所有组分放置至室温。打开小管前简短离心。
向NADPH管中加入360mL 重蒸馏水，混匀。向阳性对照管中加入500mL 缓冲液，混匀。把新配的试剂放在冰上。剩下的未使用的试剂在-20°C下可保质三周。
2、标准液和样品： 将12 mL标准品和188 mL蒸馏水混合(终浓度6 mM)。按照下表稀释，转移10 mL标准品到平底透明96孔板孔中，再加190 mL缓冲液到所有标准孔。
No
6 mM 标准品 + H2O
Vol (mL)
标准品 (mM)
1
     100mL +   0mL
100
6.0
2
      60mL +  40mL
100
3.6
3
      30mL +  70mL
100
1.8
4
       0mL + 100mL
100
       0
转移10 µL样品和10 µL新配的GPX阳性对照到平底透明的96孔板的不同孔中。另外，每次检测，都应包括一个只有10mL缓冲液的空白对照。注意：(1) 对于未知样品，应进行多次稀释，以确保GPX的活性在12 - 300 U/L的线性范围内。 (2) 实验所提供的GPX阳性对照不用于计算样品GPX的活性。
3、检测：为样品和对照孔配制足够的工作试剂。对于每孔，混合85 mL缓冲液, 2 mL谷胱甘肽, 2 mL 35 mM NADPH和8 mL GR酶。在样品/对照孔内快速加入90µL工作试剂，轻击平板混匀。
准备足够的0.35 mM H2O2试剂：用1992 mL蒸馏水稀释8 mL 3% H2O2 (终浓度3.5 mM)；对于每个样品/对照孔，混合12 mL 3.5 mM H2O2和108 mL蒸馏水得到0.35 mM H2O2 (该试剂应现配现用)。
用一个多通道移液器将100 mL 0.35 mM H2O2试剂加到所有样品和对照孔，快速轻敲平板使溶液混合均匀。
立刻在340nm处读吸光值(OD0)，在反应4分钟时再读吸光值(OD4)。
注意：如果计算出GPX的活性高于300 U/L，或在样品孔中最初的OD340nm＞1.5，用蒸馏水稀释样品重新测试，将得到的结果乘以稀释倍数n。
浓度计算
标准品, 吸光值减去对照(#4)的吸光值，根据差值描绘标准曲线，确
定斜率(Slope)。计算样品吸光值的差值DODs = (OD0 – OD4)和空白吸光值的差值DODB = (OD0 – OD4)。计算样品GPX的活性：
 
1000是单位换算(毫摩和微摩)倍数；n是样品稀释系数。
单位定义：1个酶活性单位是指在pH7.6室温条件下，每分钟生产1 mmole GS-SG的GPX活性。
实验必需品(未提供)
移液装置，离心管，透明平底96孔板，每分钟能在340nm处读吸光值的阅读仪器，高速匀浆器(e.g. Sigma # Z359971)等。
参考文献
[1]. Paglia, D.E. and Valentine, W .N. (1967). Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med. 70:158-169.
[2]. Jacobson, B. et al. (1988). Adaptation of glutathione peroxidase assay to the Technicon RA-1000. Clin Chem. 34:2164-2165.
[3]. Pascual, P. et al. (1992). Direct assay of glutathione peroxidase activity using high-performance capillary electrophoresis. J. Chromatogr. 581:49-56.