质粒被广泛用于分子生物学、细胞生物学、遗传学等领域。我们的纳米磁珠试剂盒的细胞裂解液将DNA释放出来,并进
一步变性蛋白及基因组DNA,离心后的质粒上清中DNA在特定条件下选择性吸附于纳米磁珠上,再通过快速的漂洗,将
盐,细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后用洗脱缓冲液将质粒DNA洗脱下来。质粒DNA样品可用于克隆,PCR,芯片,测序等
下游应用。 温馨提示:DNA的得率与质粒的类型、拷贝数、大小等有关。
以下试剂、器皿需操作者提前准备:
无水乙醇,分析纯异丙醇,25ml/ml RNaseA
1-1000ul 移液枪及枪头, 1.5 ml 离心管,磁力分离器,旋涡混合器,高速离心机
如发现 PB20 试剂变混浊,在 30-70
o C 水浴中加热 5-10 分钟即可。
第一次使用需准备的溶液(50T):
PB40: 加 10.5 毫升无水乙醇到 PB40 试剂瓶里,混均,并在瓶上打勾
PWB20: 加 42 毫升无水乙醇到 PWB20 试剂瓶里,混均,并在瓶上打勾
25mg/ml RNaseA:加 25mg RNase 到 1ml 10mM Tris.HCl pH7-8,每管 100ul,-20
o C 保存。留 1 管 4 o C 备用
下面是以 2-3ml 2 个 OD600 菌体为例,可根据菌体量按比例调整试剂量
I. Lysis cell and remove genomic DNA
取 1.5ml(约2 OD)对数期菌体到 1.5ml 离心管, 7k rpm,1min,弃上清液。
如菌少,可重复收集一次,再取 1.5ml 菌体到上面离心管,7k rpm,1min,弃上清液
加 200 ul PB10 到上面含菌泥的离心管里,用枪头, 充分混匀, 加 3 ul 25mg/ml RNaseA,混匀,室温放置 5 min
加 200 ul PB20, 轻轻颠倒 5-6次( 溶液应变清亮)
加 250 ul PB30, 轻轻颠倒 5-6次,
加 100 ul PB40, 轻轻颠倒 5-6次,
离心 13k rpm, 3 min
II. Capture plasmid DNA to Nano Beads
小心地取出约 650 ul 上清,放到新的 1.5ml离心管
加 650ul 异丙醇, 40 ul 刚混匀的s Nano Beads 到上步的离心管, 颠倒混匀
室温放置 5 min
把上步的离心管放到磁力分离器上 1-3 min
取出并弃上清液,注意不要取到磁珠
III. Purify DNA
加 500 ul PWB20 到上步的离心管,颠倒混匀,放置 30 sec
放到磁力分离器上 1-3min
取出并弃上清液,注意不要取到磁珠
重复PWB20 洗涤一次, 风干2-3 min
IV. Release DNA
加 100 ul EB(Elution buffer) 到上步的离心管,振荡混匀,放置 5min,轻轻混匀
放到磁力分离器上 1-3 min 或直到溶液变清亮
把上清液转到没有 DNase 的干净离心管里,注意不要取到磁珠
测试 DNA样品吸光度,每个胶孔加 5-20ul DNA溶液 跑胶;DNA 保存在-20
o C 或 -80 o C