货号: | xY-10153 |
英文名: | cAMP kit |
环磷酸腺苷放免试剂盒操作说明书
CAMP(HY-10153) RIA KIT
一、 药物供应试验
1.BSA 1瓶(用于配制0.2%BSA的醋酸缓冲液):溶于 15 毫升50mM PH 4.75
的醋酸缓冲液(配法见后)
2.乙酰化剂试剂:使用前将三乙胺和醋酐混匀即可(三乙胺和醋酐各一瓶)
3.125I- CAMP1瓶:使用时用50 mM醋酸缓冲液 10 毫升稀释标记品(约2万CPM左右/0.1ml).
4. CAMP标准1瓶:取 100 微升,用 2.6 毫升50 mM醋酸缓冲液稀释为2pmol/0.1ml,然后倍比稀释成8个浓度点:1、0.5、0.25、0.125、0.062、0.031、0.016、0.008pmol/0.1ml
(B1~B8)。
5. CAMP抗血清一瓶:使用时用含0.2%BSA的醋酸缓冲液13 毫升溶解
6.羊抗兔IgG血清1瓶,每瓶用 10 ml生理盐水溶解即可,4℃保存。
7.正常兔血清1ml,用 10 ml生理盐水溶解即可4℃保存。
8、EDTA抗凝剂1瓶。
9、醋酸缓冲液1瓶: 1:4稀释(1份该液加3份蒸馏水)。
环磷酸腺苷放免试剂盒二、操 作
CAMP RIA 加液程序 (单位: ul )
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试 剂 T NSB B0 S1~S8 样 品
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醋醋缓冲液 —— 200 100 —— ——
标 准 品 —— —— —— 100 ——
样 品 —— —— —— —— 100
乙酰化试剂 —— 5 5 5 5
抗 血 清 —— —— 100 100 100
125I-CAMP 100 100 100 100 100
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充分混匀,4℃ 过夜。
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正常兔血清 100 100 100 100 100
羊抗兔IgG 100 100 100 100 100
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充分混匀,4℃ 过夜。
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摇匀,室温放置2~3h, 3000rpm离心15分钟,吸去上清,在γ计数器上测定沉淀CPM数。
环磷酸腺苷放免试剂盒三、计算
NSB为非特异结合管,标准曲线及样本测得值均需减去NSB值,以B/B0计算标准及待测样品结合百分率,在半对数纸上绘制标准曲线,并查出样品值。或由γ计数器预先编制得程序,直接给出有关参数、标准曲线及样品浓度。或从EXEL表格中的直线回归方法计算。所得结果乘以稀释倍数即可。
四、样品收集
1、需配试剂
1) EDTA抗凝剂。取9.3克EDTA二钠盐加入1mol/L NaOH溶液25ml,溶解后加水到50ml.。
2) 50mMPH4.75醋酸缓冲液,(含4mM EDTA):取27.22克NaAc . 3H20溶于1000ml蒸馏水,即为0.2M NaAc,用冰醋酸配制0.2M醋酸,然后取410毫升0.2M HAC和590毫升0.2M NaAc混匀,测PH值调到PH 4.75,然后每1000毫升溶液加入5.95克 EDTA 二钠盐溶解即可.此溶液为200 Mm pH 4.75 的醋酸缓冲液,EDTA为16mM。使用时将该液1:4稀释。(1份该液加3份蒸馏水)即成50mM pH4.75醋酸缓冲液,含EDTA 4Mm.
环磷酸腺苷放免试剂盒2、血样本处理
1) 取静脉血1~2ml,注入含DETA抗凝剂50ul的试管中,摇匀,一小时内离心4℃,2000rpm离心10min,分离血浆, —20℃保存,严禁反复冻融。
2) 血浆处理:取0.1ml血浆加入2ml无水乙醇,振摇1分钟,静置5分钟,3000转/分离心10分钟。将上清液到入指形管或青霉素小瓶,残渣再加入75%乙醇1ml,匀浆,3000rpm离心10分钟。合并上清液,于60℃烤箱中吹干,残渣放于4℃保存。测量时用1ml醋酸缓冲液溶解,然后取0.1ml测量,此时稀释倍数为100。结果×100即为pmol/ml.
3、组织样品处理
取组织50毫克左右放入盛有2ml冷的50mM PH4.75醋酸缓冲液的试管内(冰浴),匀浆,加入2ml无水乙醇,混匀,静止5分钟,3500转离心15分钟,将上清液收集在青霉素小瓶内,再用75%乙醇2ml洗沉淀,匀浆分散,混匀,3500转离心15分钟。合并上清液,60℃烤箱中吹干,残渣放于4℃保存。测量时用1ml醋酸缓冲液溶解,然后取0.1ml测量。
4、对于血、组织样本,不同血样或组织中的CAMP或CGMP含量不同,测试前最好预实验确定样品稀释度。
五、正常人血浆参考值:
CAMP:23.1±7.7pmol/ml
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温馨提示:不可用于临床治疗。