TTC(2,3,5—氯化三***基四氮唑)可溶于水,但被正常组织线粒体内的某些脱氢酶还原后形成深红色的脂溶性光敏感成分,所以TTC的染色效果与线粒体脱氢酶的活性有密切关系,正常组织被染成深红色,而缺血坏死组织因为脱氢酶活性丧失TTC不能被还原,故不被染色,呈苍白色(图6.5)。早在1958年,TTC就开始被用来检测哺乳动物组织的缺血梗塞,现在广泛用于检测心脏、脑缺血的改变。本产品为Ameresco原装进口或分装,分10g、25g、100g粉末包装。
操作说明:(最好在缺血发生后至少6小时再开始染色,否则梗死区和正常组织的染色边界不清晰)
1 制备局灶性脑缺血动物模型,如线栓法MCAO模型。
2 实验结束后(至少缺血后6h),迅速断头取脑,取脑要完整,包括大脑半球和小脑。
3 在-20°C冰箱冷冻约15-20分钟(具体时间以达到不软不硬,便于切片为宜)。
4 从冰箱取出,立即用组织切片刀片在脑切片模具中切成厚度均匀的1-3mm后的切片。(徒手切片不能保证脑片的准确厚度,计算得到的梗死体积误差很大,影响文章的发表和数据的可信性)
5 将脑片立即置于2%的TTC染色液中,37度避光孵育约10-15分钟,中间可以随时观看染色效果,并上下翻面,直到正常脑组织染成鲜艳的红色为止,如有梗死区,则为苍白色(见图13)。如染成深紫红色,表示染色时间太长。
6 取出染色的脑片,置固定液中固定后进行图像分析,计算脑梗死体积的大小。染色的脑片长时间在固定液中会逐渐退色,建议尽快处理(最好不超过24h)。
更多内容请参考文献: 1 Hatfield RH, et al. Neuropathol Appl Neurobiol. 1991; 17: 61-67.
2 Bederson J, et al. Stroke, 1986;17:1304-1308.