肿瘤靶向用药指导---焦***酸测序法
一、焦***酸测序简介
焦***酸测序 (pyrosequencing)是一项全新的DNA序列分析技术,能快速、准确的对已知的短序列进行分析,通过荧光信号强度定量检测各种突变型与野生型细胞形成的异质性组织。与传统Sanger测序法相比,具有敏感高、准确性好、更快速、可重复性和自动化的特点。
肿瘤基因突变检测如遇到送检组织肿瘤细胞含量较少,或肿瘤细胞仅含少量突变型基因,sanger测序法结果峰图中目标突变碱基峰通常不明显,与背景信号相似,这种情况比较难以做出判断,而焦***酸测序因灵敏度更高则能解决上述问题。
二、测序方法及原理
测序原理:测序引物与生物素标记的PCR单链核苷酸模板退火。酶和底物与模板共同孵育。首个核苷酸加入到测序反应中。如果其与模板链上的碱基互补,则在DNA聚合酶的催化下结合到DNA链上。每次互补结合都会释放与核苷酸摩尔量相当的焦***酸(PPi)。在腺苷-5-***酸硫酸酐(adenosine 5 phosphosulfate,APS)的条件下,ATP硫酸化酶将PPi转化为ATP。ATP驱动荧光素酶介导的荧光素氧化,发出与ATP量成正比的可见光。荧光素酶催化反应产生的可见光经电荷耦合器(CCDs)检测,可在原始数据输出中看到一个峰值(Pyrogram®)。光信号与结合的核苷酸量成正比。
三、技术优势
1.准确性高:测序是检测基因序列和突变的“金标准”,结果更可信,而且可准确鉴定未知突变 ;
2.灵敏度高:突变分析灵敏度可达5%,远高于普通Sanger测序的20%突变分析灵敏度;
3.通量高:可同时平行分析24/96个样本 。
4.检测时间:较Sanger测序时间短,PCR反应之后,仅需1个小时内完成实验报告。
四、产品列表
1、靶基因: EGFR
检测位点: exon18、19、20、21
临床意义: 用于非小细胞肺癌等肿瘤的用药指导;通常突变患者对该类药物的治疗敏感,野生型患者对该类药物的治疗不敏感
2、靶基因:KRAS
检测位点: exon2、3
临床意义:用于非小细胞肺癌等肿瘤的用药指导;仅野生型患者对该类药物的治疗敏感,同时突变型患者使用该类药物还可能导致有害效应。
3、靶基因:PIK3CA
检测位点: exon9、20
临床意义:西妥昔单抗和帕尼单抗的用药指导
4、靶基因:BRAF
检测位点: exon15
临床意义:用于结直肠癌、头颈部鳞癌等肿瘤的用药指导;野生型患者对该类药物的治疗敏感,突变型患者对该类药物的治疗不敏感
5、靶基因:JAK2
检测位点: exon12
临床意义:慢性骨髓增殖性疾病(MPD)主要的诊断指标
6、靶基因:C-Kit
检测位点: exon9、11
临床意义:用于胃肠道间质瘤的用药指导
7、靶基因:PDGFRA
检测位点: exon12、18
临床意义:用于胃肠道间质瘤的用药指导;突变患者通常对该药物的治疗敏感,野生型患者对该药物的治疗不敏感;D842V突变患者对该药耐药。
8、靶基因:UGT1A1
检测位点: 基因多态性
临床意义: 用于成年患者耐药或不能耐受既往治疗包括伊马***和达沙***的慢性期和加速期费城染色体阳性慢性粒细胞性白血病和急性淋巴细胞白血血病的用药指导。