土壤中性转化酶(S-NI)活性检测试剂盒
产品内容:
提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体60mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加入30mL试剂一充分溶解备用;用不完的试剂4℃保存。
试剂三:液体35mL×1瓶,4℃保存。
标准品:粉剂×1支,4℃保存,10mg无水葡萄糖。临用前加入1mL蒸馏水溶解,制备10mg/mL葡萄糖标准液备用。
产品说明:
蔗糖转化酶(Invertase,Ivr)催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖,是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适 pH,将高等植物Ivr分为酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI)两种类型。NI主要存在于细胞质中,负责分解细胞质中蔗糖为果糖和葡萄糖。 NI催化蔗糖分解产生还原糖,进一步与3,5-二**水杨酸反应,生成棕红色氨基化合物,在540nm有特征光吸收,在一定范围内540nm光吸收值与还原糖生成量成正比。通过光吸收增加速率来计算NI活性。
试验中所需的仪器和试剂:
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水。
土壤中性转化酶(S-NI)活性检测试剂盒
操作步骤:
一、粗酶液提取:
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。12000g ,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
二、标准曲线绘制
将标准品稀释成1.0、0.8、0.6、 0.4、0.2、0mg/mL葡萄糖标准液,按照测定步骤分别测定1.0、0.8、0.6、 0.4、0.2、0mg/mL葡萄糖标准液在540nm下的吸光度(A),以各浓度下吸光值减空白管(浓度为0mg/mL)的吸光度为y轴,葡萄糖浓度为x轴绘制标准曲线。
三、测定步骤及加样表:
按下表操作:
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 |
样本 | 200 | 200 | - |
试剂一 | - | 800 | - |
试剂二 | 800 | - | 800 |
标准液 | - | - | 200 |
混匀,37℃准确水浴30min后,煮沸10min左右(盖紧,以防止水分散失),流水冷却后充分混匀(以保证浓度不变),12000 g,4℃离心5min,取上清。 | |||
试剂三 | 500 | 500 | 500 |
混匀,煮沸10min左右(盖紧,以防止水分流失),流水冷却后充分混匀,540nm处蒸馏水调零,记录各管吸光值A,ΔA=A测定-A对照。
四、注意事项:
1、如果加入试剂三,煮沸10min后有混浊物出现,建议离心除去沉淀后,取上清测定吸光度;
2、如果吸光值大于1,可以用蒸馏水将样本稀释后测定(计算公式中乘以相应稀释倍数)
土壤中性转化酶(S-NI)活性检测试剂盒
五、N I 活性计算:
标准条件下测定的回归方程为y=kx+b;x为标准品浓度(mg/mL),y为吸光值。
1、 按蛋白浓度计算
单位定义:37℃每mg蛋白每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。
NI活性(U/mg prot)=(x×V1×1000)÷(V1×Cpr)÷T=33.3 ×x÷Cpr
2、 按鲜重计算
单位定义:37℃每g组织每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。
NI活性(U/g)=(x×V1×1000)÷(W×V1÷V2)÷T=33.3 ×x÷W
1000:1 mg/mL =1000μg/mL ;V1:加入反应体系中样本体积,0.2mL;V2:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g;T:反应时间:30min。
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