产品内容:
提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体15mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前加5mL双蒸水充分溶解。用不完的试剂-20℃保持,禁止反复冻融。
试剂三:液体2mL×1瓶,4℃保存。
产品说明:
乙醇酸氧化酶(EC1.1.3.15)是植物光呼吸代谢中的关键酶,也是光下合成草酸的关键酶,它催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,对研究光呼吸代谢过程及其调控具有重要意义。
乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,乙醛酸和盐酸***肼反应生成乙醛酸***腙,在324nm 有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器
天平、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板(UV板)。操作步骤:
一、酶液提取
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10 的比例(建议称取约0.1g 组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。12000g, 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
二、测定操作
测定管
样本(μL)
10
试剂一(μL)
130
试剂二(μL)
40
试剂三(μL)
20
充分混匀,立即于1mL 石英比色皿中测定324nm 处10s和190s 吸光值A1 和A2,△A=A2- A1
三、计算公式:
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
(1) 按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义:每毫克蛋白每分钟氧化1 nmol 乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。
GO活性(nmol/min /mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr) ÷T=392×ΔA÷Cpr
(2)按照样本质量计算
酶活单位定义:每克组织每分钟氧化1 nmol 乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。
GO(nmol/min /g)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T= 392×ΔA÷W
ε:乙醛酸***腙毫摩尔消光系数:17L/mmol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 反总:反应总体积,0.2V 样:反应中样本体积,0.01L;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W,样本质量,g;T:反应时间,3min。
b. 用96孔板测定的计算公式如下:
(1) 按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义:每毫克蛋白每分钟氧化1 nmol 乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。
GO活性(nmol/min /mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr) ÷T=784×ΔA÷Cpr
(2)按照样本质量计算
酶活单位定义:每克组织每分钟氧化1 nmol 乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。
GO(nmol/min /g)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T= 784×ΔA÷W
ε:乙醛酸***腙毫摩尔消光系数:17L/mmol/cm;d:比色皿光径,0.5cm;V 反总:反应总体积,0.2V 样:反应中样本体积,0.01L;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W,样本质量,g;T:反应时间,3min。
注意事项:
1. 测定之前进行预实验,若吸光值较高,请将样品用提取液进行适当的稀释再测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。
2. 色素含量较高的样品,可在提取酶时加活性炭吸附。