脱氢抗坏血酸还原酶活性测定试剂盒 UV板 微量法

产品内容：
试剂一：液体×1 瓶，4℃保存； 
试剂二：液体×1 瓶，4℃保存； 
试剂三：粉剂×1 瓶（棕色），4℃保存。临用前加入 2.5mL 蒸馏水充分溶解；
 试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 2.5mL 蒸馏水充分溶解。
产品说明：
DHAR 存在于线粒体、细胞质和叶绿体中。DHAR 催化 GSH 还原 DHA 生成 AsA，调控细 胞 AsA/DHA 比值，是抗坏血酸-谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶。提高植物体内的 DHAR 活性， 可提高植物食品中 AsA 含量，进而提高植物食品的营养品质。 
DHAR 催化 GSH 还原 DHA 生成 AsA， 通过测定 DHA 被还原量可计算得 DHAR 活性。
试验中所需的仪器和试剂：
研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、可调式移液 器、蒸馏水。
 
操作步骤：
一、粗酶液提取 ：   
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积（ml）1：5-10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 试剂一进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。 
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10 4个）：试剂一体积（ml）为 500-1000：1 的比例（建议 500 万 细胞加入 1ml 试剂一），冰浴超声超声破碎细胞（功率 300w，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min）； 然后 8000g，4℃，离心 20min，取上清置于冰上待测。 
3. 血清等液体：直接测定。
 
二、测定操作表：
1. 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长到 265nm，蒸馏水调零。 
2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30min 以上。 
3. 在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中依次加入 20μL 上清液、20μL 试剂三、20μL 试剂四和 140μL 试 剂二，迅速混匀后于 265nm 比色，记录 30s 和 150s 的吸光值 A1 和 A2，△A=A2-A1。
三、DHAR活性计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下： 
（1） 按蛋白浓度计算 
活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1U。 
DHAR (nmol/min/mg prot) =[△A÷ε÷d×V 反总×10 9 ]÷（Cpr×V 样）÷T =92×△A ÷Cpr 
（2） 按样本质量计算 
活性单位定义：25℃中每克样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1U。 
DHAR (nmol/min/g) =[△A÷ε÷d×V 反总×10 9 ]÷（W×V 样÷V 样总）÷T =92×△A ÷W 
（3） 按细胞数量计算 
活性单位定义：25℃中每 10 4个细胞每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1U。 
DHAR (nmol/min/10 4cell) =[△A÷ε÷d×V 反总×10 9 ]÷（细胞数量×V 样÷V 样总）÷T =92×△A ÷细胞数量 
（4） 按液体体积计算 
活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1U。 
DHAR (nmol/min/mL) =[△A÷ε÷d×V 反总×10 9 ]÷V 样÷T =92×△A 
ε: AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数，5.42×10 4L/mol/cm；10 9：摩尔分子换算成微摩尔分子；d： 比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10 -4L；V 样：加入反应体系中上清液体积， 20μL=0.02mL；V 样总：提取液体积，1mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/ml；W：样品质量，g；T： 反应时间，2min。
 
 b.使用 96 孔 UV 板测定的计算公式如下： 
（1）按蛋白浓度计算 
活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1U。 
DHAR (nmol/min/mg prot) =[△A÷ε÷d×V 反总×10 9 ]÷（Cpr×V 样）÷T =184×△A ÷Cpr 
（2）按样本质量计算 
活性单位定义：25℃中每克样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1U。 
DHAR (nmol/min/g) =[△A÷ε÷d×V 反总×10 9 ]÷（W×V 样÷V 样总）÷T =184×△A ÷W 
（3）按细胞数量计算 
活性单位定义：25℃中每 10 4个细胞每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1U。 
DHAR (nmol/min/10 4cell) =[△A÷ε÷d×V 反总×10 9 ]÷（细胞数量×V 样÷V 样总）÷T =184×△A ÷细胞数量 
（4）按液体体积计算 
活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1U。 
DHAR (nmol/min/mL) =[△A÷ε÷d×V 反总×10 9 ]÷V 样÷T =184×△A 
ε: AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数，5.42×10 4L/mol/cm；10 9：摩尔分子换算成微摩尔分子；d： 比色皿光径，0.5cm；V 反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10 -4L；V 样：加入反应体系中上清液体积， 20μL=0.02mL；V 样总：提取液体积，1mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/ml；W：样品质量，g；T： 反应时间，2min。 
 
注意事项： 
临用前配置的试剂未使用完的 4℃保存，3 天内使用完成。