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谷胱甘肽还原酶测定试剂盒

产品价格: ¥240.00

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长期有效
最后更新:
1970-01-01 08:00:00
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产品详情

品牌名称:

产品内容: 

试剂一:液体×1 瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 5.0 mL 蒸馏水,混匀。

试剂三:液体×1 支,4℃保存。

 

产品说明: 

GR 是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶,是谷胱甘肽氧化还原循环的 关键酶之一(通常昆虫中 GR 被 TrxR 取代)。GR 催化 NADPH 还原 GSSG 生成 GSH,有助于维 持体内 GSH/GSSG 比值。GR 在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用,此外 GR 还参与抗坏血 酸-谷胱甘肽循环途径。 GR能催化 NADPH 还原 GSSG 再生 GSH,同时不断消耗 NADPH 生成 NADP +;NADPH 在 340nm 有特征吸收峰,相反 NADP +在该波长无吸收峰;通过测定 340nm 吸光度下降速率;来测定 NADPH 脱氢速率,从而计算 GR 活性。

 

自备仪器和用品: 紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、移液器、 1mL 石英比色皿和蒸馏水。

 

操作步骤: 

一、粗酶液提取: 

1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(ml)1:5-10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1ml 试剂一进行冰浴匀浆。10000rpm,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(10 4个):试剂一体积(ml)为 500-1000:1 的比例(建议 500 万 细胞加入 1ml 试剂一),冰浴超声超声破碎细胞(功率 300w,超声 3s,间隔 7s,总时间 3min); 然后 10000rpm,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

 

二、GR 测定操作: 

1. 分光光计预热 30 min 以上,调节波长到 340 nm,蒸馏水调零。

2. 试剂一置于 25℃(普通物质)或者 37℃(哺乳动物)中预热 30min 以上。

3. 空白管:取 1mL 石英比色皿,加入 850μL 试剂一,100μL 试剂二,50μL 试剂三,充分混匀, 于 340nm 处测定 10 s 和 190 s 吸光度,记为 A 空 1 和 A 空 2,△A 空白管= A 空 1﹣A 空 2。

4. 测定管:取 1mL 石英比色皿,加入 750μL 试剂一,100μL 试剂二, 100μL 上清液,50μL 试 剂三,充分混匀,于 340nm 处测定 10 s 和 190 s 吸光度,记为 A 测 1 和 A 测 2,△A 测定 管= A 测 1﹣A 测 2。

注意:空白管只需要测定一次。

 

三、GR 活性计算: 

(1) 按蛋白浓度计算

活性单位定义:在一定温度中, pH8.0 条件下,每 毫克蛋白每分钟催化 1μmol NADPH 氧化。

GR 酶活(U/mg prot)= [ (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×10 6] ÷(Cpr×V 样)÷T =0.536×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr

(2) 按样本质量计算

活性单位定义:在一定温度中, pH8.0 条件下,每克样本每分钟催化 1μmol NADPH 氧化。

GR 酶活(U/g)= [ (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×10 6] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T =0.536×(△A 测定管-△A 空白管)÷W

(3) 按细胞数量计算

活性单位定义:在一定温度中,pH8.0 条件下,每 10 4个细胞每分钟催化 1μmol NADPH 氧化。

GR 酶活(U/10 4 cell)= [ (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×10 6] ÷(细胞数量×V 样÷V 样 总)÷T=0.536×(△A 测定管-△A 空白管)÷细胞数量

ε:NADPH 摩尔消光系数 6.22×10 3L/mol/cm;V 反总:反应体系总体,1000μL=0.001 L;10 6: 1 mol=1×10 6μmol;Cpr:上清液蛋白浓度( mg/mL);V 样:加入反应体系中上清液体积,100μL =0.1 mL;V 样总:加入提取液体积ˈ 1mL;W,样本质量,g;T:反应时间,3 min。

 

注意事项: 

1. 样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力,匀浆液避免反复冻融;

2. 试剂二须现配现用,配置完后,置于冰上;

3. 测定前须先用 1~2 个样做预实验,确保 180s 内吸光值变化呈线性,哺乳动物组织一般须用试 剂一稀释 2~5 倍;

4. 细胞中 GR 活性测定时,细胞数目须在 300 万-500 万之间,细胞中 GR 的提取时可加试剂一 后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞。

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