NADP-苹果酸脱氢酶测定试剂盒 微量法

产品内容
试剂一、提取液 100 mL×1 瓶，在 4℃保存； 
试剂二、液体 20 mL×1 瓶，在 4℃保存； 
试剂三、粉剂×1 支，-20℃保存；
产品说明
MDH （EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中 MDH 是 TCA 循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中 MDH 催化草酰乙酸形成苹果酸。草 酰乙酸是重要的中间产物，连接多条重要的代谢途径。因此，MDH 在细胞多种生理活动中扮演着 重要的角色，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不 同的辅酶特异性，MDH 分为 NAD-依赖的 MDH 和 NADP-依赖的 MDH， NADP-MDH 主要存在于 真核细胞中。 NADP-MDH 催化 NADPH 还原草酰乙酸生成苹果酸，导致 340nm 处光吸收下降。 
自备仪器和试剂 紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板和蒸 馏水。
操作步骤
一、 样本测定的准备： 
1、细菌、细胞或组织样品的制备： 
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）： 试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一），超声波破 碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min， 取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 
2、血清（浆）样品：直接检测。 
二、 测定步骤： 
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。 
2、检测工作液的配置：用时在试剂三中加入 19ml 试剂二和 0.5ml 蒸馏水，充分混匀待用；现用现 配； 
3、测定前将检测工作液在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上。 
4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 5uL 样本和 195uL 工作液，混匀后立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 1min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2
注意：若 A1-A2 大于 0.5，需将酶液用提取液稀释，使 A1-A2 小于 0.5，可提高检测灵敏度。 计算公式中乘以相应稀释倍数。 
三、 NADP-MDH 活力单位的计算： 
a、用微量石英比色皿测定的计算公式如下 
1、血清（浆）NADP-MDH 活力的计算 
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADP-MDH（U/mL）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷V 样÷T=6430×ΔA 
2、组织、细菌或细胞中 NADP-MDH 活力的计算: 
（1） 按样本蛋白浓度计算： 
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADP-MDH（U/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(V 样×Cpr) ÷T =6430×ΔA÷Cpr 
（2） 按样本鲜重计算： 
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADP-MDH（U/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷（W× V 样÷V 样总）÷T =6430×ΔA÷W 
（3） 按细菌或细胞密度计算： 
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADP-MDH（U/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷（500×V 样÷V 样总）÷T =12.86×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比 色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.005mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时 间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞或细菌总数，500 万。 
b、用 96 孔板测定的计算公式如下 
1、血清（浆）NADP-MDH 活力的计算 
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADP-MDH（U/mL）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷V 样÷T=12860×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 NADP-MDH 活力的计算: 
1) 按样本蛋白浓度计算： 
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADP-MDH（U/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(V 样×Cpr) ÷T =12860×ΔA÷Cpr 2) 按样本鲜重计算： 
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADP-MDH（U/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷（W× V 样÷V 样总）÷T =12860×ΔA÷W 
3) 按细菌或细胞密度计算： 
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADP-MDH（U/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷（500×V 样÷V 样总）÷T =25.72×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；
ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板 光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.005mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间， 1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞或细菌总数，500 万