产品内容:
试剂一、提取液 100mL×1 瓶,在 4℃保存;
试剂二、液体 20mL×1 瓶,在 4℃保存;
试剂三、粉剂×1 瓶,-20℃保存;
产品说明:
MDH(EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中 MDH 是 TCA 循 环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中 MDH 催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰 乙酸是重要的中间产物,连接多条重要的代谢途径。因此,MDH 在细胞多种生理活动中扮演着重 要的角色,包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同 的辅酶特异性,MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH,细菌中通常只含有NAD-MDH, 在真核细胞中,NAD-MDH 分布于细胞质和线粒体中。 NAD-MDH 催化 NADH 还原草酰乙酸生成苹果酸,导致 340nm 处光吸收下降。
需自备的仪器和用品: 紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板和蒸 馏水。
操作步骤:
一、样本测定的准备:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(10 4 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一),超 声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离 心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
二、测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、检测工作液的配制:用时在试剂三中加入 19mL 试剂二和 0.5mL 蒸馏水,充分混匀待用;现配 现用;
3、测定前将检测工作液在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min 以上。
4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 5μL 样本和 195μL 工作液,混匀后立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 1min20s 后的吸光值 A2,计算ΔA=A1-A2。
注意:若 A1-A2 大于 0.5,需将样本用提取液稀释,使 A1-A2 小于 0.5,可提高检测灵敏度。 计算公式中乘以相应稀释倍数。
三、NAD-MDH 活力单位的计算:
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清(浆)NAD-MDH 活力的计算
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH(nmol/min /mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10 9]÷V 样÷T=6430×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 NAD-MDH 活力的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 NAD-MDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10 9]÷(V 样×Cpr) ÷T =6430×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10 9]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=6430×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 NAD-MDH(nmol/min /10 4cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10 9]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=12.86×ΔA V 反总:反应体系总体积,2×10 -4L;
ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×10 3L/mol/cm;d:比色皿光径, 1cm;V 样:加入样本体积,0.005 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min; W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;500:细胞或细菌总数,500 万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
1、血清(浆)NAD-MDH 活力的计算
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 NAD-MDH(nmol/min /mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10 9]÷V 样÷T=12860×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 NAD-MDH 活力的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 NAD-MDH(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10 9]÷(V 样×Cpr) ÷T =12860×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织中每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10 9]÷(W×V 样÷V 样总)÷T =12860×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 NAD-MDH(nmol/min/10 4cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10 9]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=25.72×ΔA V 反总:反应体系总体积,2×10 -4L;
ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×10 3L/mol/cm;d:96 孔板光 径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.005 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;500:细胞或细菌总数,500 万。