HifairTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)

 
HifairTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 
  
(gDNA digester plus)
  
产品信息
  
  
   
产品名称
   
产品编号
   
规格
   
储存
   
价格（元）
  
  
   
HifairTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)
   
11121ES60
   
100T
   
-20℃
   
935.00
  
  
   
 
   
 
   
 
   
 
   
 
  
 
  
产品描述
  
HifairTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)是含有基因组DNA去除步骤的cDNA第一链合成试剂盒。该试剂盒基于HifairTM Ⅱ Reverse Transcriptase而开发。与HieffTM M-MLV (H-) Reverse Transcriptase相比，HifairTM Ⅱ Reverse Transcriptase热稳定性大幅度提高，可耐受高达50℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。HifairTM Ⅱ Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可扩增长达10 kb的cDNA。
    
该试剂盒包含gDNA digester，可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠。该试剂盒提供两种cDNA合成引物：Random Primers N6 和oligo (dT)18，用户可根据需要，选择Random Primers N6，Oligo (dT)18或Gene Specific Primers作为逆转录引物，合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。
  
产品组分
  
  
   
编号
   
组分
   
产品编号/规格
  
  
   
11121ES60 (100 T)
  
  
   
11121-A
   
RNase free ddH2O
   
2×1 mL
  
  
   
11121-B
   
5×gDNA digester Buffer
   
200 μL
  
  
   
11121-C
   
gDNA digester
   
100 μL
  
  
   
11121-D
   
5×HifairTM Ⅱ Buffer plus
   
400 μL
  
  
   
11121-E
   
HifairTM Ⅱ Enzyme Mix
   
200 μL
  
  
   
11121-F
   
dNTP（10 mM）
   
100 μL
  
  
   
11121-G
   
Oligo (dT)18 (50 μM) 
   
100 μL
  
  
   
11121-H
   
Random Primers N6 (50 μM)
   
100 μL
  
 
  
【注】：1）5×HifairTM Ⅱ Buffer plus包含gDNA digester抑制剂；2）HifairTM Ⅱ Enzyme Mix包含RNase inhibitor。
  
运输与保存方法
  
干冰运输。-20℃保存。
  
注意事项
  
1）反应液的配制应在冰上操作完成，操作过程应避免RNase污染；
  
2）如果加入RNA模板体积较大 (如超过2 μL)，请确保RNA是溶于水中而不是TE中，因为TE会对gDNA去除以及逆转录反应产生抑制； 
  
3）可以不经过基因组去除步骤，直接进行逆转录，这样所得到的结果会与使用HifairTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Cat No. 11119ES）效果一致。但是请勿将gDNA digester与11119ES中的5×HifairTM Ⅱ Buffer配套使用，因其不含终止gDNA digester反应的成分，会影响反转录和后续的qPCR实验。
 
第一链cDNA合成操作步骤
  
一、若实验需要去除残留基因组DNA
  
1.在RNase free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。
  
  
   
组分
   
使用量
  
  
   
RNase free ddH2O
   
To 10 μL
  
  
   
5×gDNA digester Buffer
   
2 μL
  
  
   
gDNA digester
   
1 μL
  
  
   
模板RNA
   
Total RNA: 1 ng -5 μg或mRNA:1 ng-500 ng 
  
 
  
2. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）
  
  
   
组分
   
使用量
  
  
   
RNase free ddH2O
   
To 20 μL
  
  
   
上一步的反应液
   
10 μL
  
  
   
5×HifairTM Ⅱ Buffer plus
   
2 μL※
  
  
   
HifairTM Ⅱ Enzyme Mix
   
2 μL
  
  
   
dNTP（10 mM）
   
1 μL
  
  
   
Random Primers N6 (50 μM)  
   
1 μL
  
  
   
or Oligo (dT)18 (50 μM) 
   
or Gene Specific Primers (2 μM)
   
or 1 μL
  
  
   
or 1 μL
  
 
  
※ 特别提醒：由于上一步反应液gDNA digester buffer的影响，本体系中5×HifairTM Ⅱ Buffer plus只需要加2 μL。
  
   加入5×HifairTM Ⅱ Buffer plus之后需要先混匀后再加入反转录引物，以完全抑制gDNA digester的活性。
  
3. 逆转录程序设置
  
  
   
温度
   
时间
  
  
   
25℃
   
5 min
  
  
   
42℃
   
30 min
  
  
   
85℃
   
5 min
  
 
  
【注】：1）荧光定量实验可以只使用Random Primers N6；也可以1:1与Oligo (dT)18混合使用，效果更好。 
  
2）逆转录温度：推荐使用42℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到50℃。
  
3）逆转录产物可以-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。
 
二、若实验无需去除基因组DNA
1. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）
  
   
组分
   
使用量
  
  
   
RNase free ddH2O
   
To 20 μL
  
  
   
模板RNA
   
Total RNA: 1 ng -5 μg或mRNA:1 ng-500 ng 
  
  
   
5×HifairTM Ⅱ Buffer plus
   
4 μL※
  
  
   
dNTP（10 mM）
   
1 μL
  
  
   
Oligo (dT)18 (50 μM) or Random   Primers N6 (50 μM)
   
1 μL
  
  
   
HifairTM Ⅱ Enzyme Mix
   
2 μL
  
 
※ 特别提醒：由于没有gDNA digester buffer的影响，本体系中5×HifairTM Ⅱ Buffer plus需要加4 μL。
为了提高反转录的效率，推荐将RNA、H2O、反转录引物在65℃保温5 min 后，冰上迅速冷却。然后再加入反转录酶。
2. 逆转录程序设置
  
   
温度
   
时间
  
  
   
25℃
   
5 min
  
  
   
42℃
   
30-60 min
  
  
   
85℃
   
5 min
  
 
【注】：1）荧光定量实验可以只使用Random Primers N6；也可以1:1与Oligo (dT)18混合使用，效果更好。 
2）逆转录温度：推荐使用42℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到50℃。
3）逆转录产物可以-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。
引物选择
1） 如果模板为真核生物来源，建议选择Oligo (dT)18 ，与真核生物mRNA的3’ Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。 
2）原核生物RNA的反转录请选用Random Primers N6或者基因特异性引物。 <, /span>
3）Random Primers N6适用性较广，mRNA、rRNA、tRNA、small RNA和LncRNA等模板均可用Random Primers N6进行反转录。
4）使用Random primers N6，进行2 kb以下的cDNA合成时，Random primers N6的使用量为 1-2 μL；2 kb 以上的cDNA合成时，Random primers N6 的使用量为0.4-1 μL。
 
 
HB180306