HisSep Ni-NTA Agarose Resin
His标签蛋白琼脂糖纯化树脂
产品信息
产品描述
HisSep Ni-NTA Agarose Resin以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质,通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸(NTA)为配体,螯合镍离子(Ni2+)后,形成非常稳定的八面体结构,镍离子处于八面体的中心,这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻,与Ni-IDA树脂相比,更加稳定,可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。已经成为实验室纯化His标签蛋白不可获取的树脂之一。
产品性质
运输和保存方法
冰袋运输。4℃保存。有效期2年。
注意事项
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
(一)纯化流程
1 缓冲液的准备
缓冲液使用原理:低咪唑上样,高咪唑洗脱,或者高pH上样,低pH洗脱。Buffer 在使用前最好用0.22μm或0.45μm滤膜过滤除菌。可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需配方详见附表1。包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表2。
2 样品准备
2.1 细菌表达的蛋白(本说明以细菌表达的蛋白纯化为例)
1)挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中,根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
2)表达结束后,将培养液转至离心瓶,7000rpm,离心15min,收集菌体,然后加入1/10体积的裂解液(Lysis buffer)和PMSF(PMSF在破碎前加入,其终浓度为1mM),同时也可加入其他蛋白酶抑制剂,但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
3)之后加入溶菌酶,使其工作浓度为1mg/ml。【注】:如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE,可以不加入溶菌酶。
4)将菌体沉淀悬浮起来(如果菌液浓度高,可考虑加入10μg/ml RNase A和5μg/ml DNase I),混匀,置于冰上超声破碎细胞,至菌液基本保持澄清。
5)收集上述澄清蛋白液,10000rpm,4℃离心20-30min。取上清0.22μm或0.45μm滤膜过滤后置于冰上备用或-20℃保存。
2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白
将细胞培养液转移至离心瓶,5000rpm离心10min,收集上清。如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等,即可直接上柱纯化;如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质,则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。
【注】:对于大量体积的上清,需加入硫酸铵进行沉淀浓缩,之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。
2.3 包涵体蛋白纯化(以细菌为例)
1)将培养液转移至离心瓶,7000rpm,离心15min,收集菌体去上清。
2)按照菌体:裂解液=1:10(w/v)的比例将菌体充分悬浮,混匀,冰浴超声破碎。
3)将破碎液转移至离心管,10000rpm,4℃离心20-30min,去上清。可重复步骤2)和3)一次。
4)按照菌体:裂解液(含8M尿素)=1:10(w/v)的比例将包涵体充分悬浮。
5)变性条件下纯化His标签蛋白纯化。
3样品纯化
1)装柱:将HisSep Ni-NTA Agarose Resin借助重力的作用装入合适的纯化柱中。
2)清洗:3-5倍柱体积去离子水冲洗色谱柱。
3)平衡:至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。
4)上样:注意控制加样速度,确保目的蛋白与Ni2+充分接触,以提高纯化得率。
【注】:注意收集流出液,用于后续SDS-PAGE检测蛋白的结合情况。
5)平衡/洗杂:Wash Buffer 平衡柱子,直到紫外吸收达到一个稳定的基线(一般至少10-15个柱体积)。注意收集流出液。
【注】:在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。
6)洗脱:使用5-10倍柱体积Elution Buffer洗脱,收集洗脱液即目的蛋白溶液。
7)清洗:依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。
【注】:建议在清洗之前用更高浓度咪唑(如500mM)彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。
8)保存:5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂,最后将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中,置于4℃保存。
4 SDS-PAGE检测
将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等)利用SDS-PAGE进行检测,判定其纯化效果。
(二)在位清洗
当填料使用过程中发现反压过高(>0.5Mpa)或者填料上面出现明显的污染时,需对其进行在位清洗(Cleaning-in-Place,CIP)。在位清洗时,先把Ni2+脱掉,清洗结束后,将填料保存在20%乙醇中,后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物,如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。
1 去除强疏水结合的蛋白,脂蛋白和脂类
使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积,接触时间为15-20min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1M醋酸溶液,接触时间为1-2h。去污剂处理后,需用70%的乙醇清洗5倍柱体积,彻底去除去污剂。最后利用去离子水清洗10倍柱体积。
2 去除离子作用结合的蛋白
使用1.5M NaCl 溶液接触10-15min,之后用去离子水清洗10倍柱体积。
(三)填料再生
当填料使用过程中发现反压过高,填料上面出现明显的污染,或填料载量明显变低时,需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理,即填料再生。按照下面操作流程进行:
1)使用0.2M 醋酸溶液(含6M GuHCl)清洗2倍柱体积;
2)去离子水清洗5倍柱体积;
3)2%SDS清洗3倍柱体积;
4)去离子水清洗5倍柱体积;
5)乙醇清洗5倍柱体积;
6)去离子水清洗5倍柱体积;
7)100mM EDTA(pH 8.0)清洗5倍柱体积;
8)去离子水清洗5倍柱体积;
9)100mM NiSO4清洗5倍柱体积;
10)去离子水清洗10倍柱体积。
填料再生后,可立即使用,也可保存在20%乙醇中,置于4℃备用。
附表1 可溶性His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方
附表2 包涵体His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方
附表3 HisSep Ni-NTA Agarose Resin试剂耐受情况
附表4 问题及解决方案
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