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QIAGEN Plasmid Midi Kit
Bind-Silane 亲和硅烷
硼硅玻璃巴斯德滴管
TNT® T7/SP6 Coup
D-Ribose D-核糖
HeLaScribe® Nucl
YeaRed Nucleic Acid 
Deoxyribonuclease I 
BenchTop φX174 DNA/
脱氧核糖核苷三磷酸溶
DIG-High Prime DNA LFura-2, AM, Cell Permeant 细胞膜可渗透钙离子荧光探针
产品信息
产品描述
Fura-2，细胞生物学常用的一种钙荧光探针，能特异性地结合Ca2+（结合比例为1:1），同时可发出荧光，结合Ca2+后的最大激发波长从结合前的380nm向340nm（Ca2+饱和时）偏移，其发射荧光强度与结合Ca2+的浓度存在定量关系。一般用340nm和380nm波长激发Fura-2，通过使用与两种激发对应的荧光强度比率来计算细胞内的钙离子浓度，这种比率测量方法可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异，荧光探针的渗漏，细胞厚度差异等一些误差因素。Fura-2与Indo-1已成为目前使用最广泛的比率测量的钙荧光指示剂。目前适用于Fura 2实验的设备有很多，但Fura-2特别适合于数字成像显微镜，使用该设备可更方便的调整激发波长，使探针结合钙离子后在300-400nm的激发波长范围内扫描Fura-2的吸收偏移，在510nm处检测发射波长。
由于Fura-2是极性大的酸性化合物，无法进入细胞内，为此在其负性基团上结合乙酰氧甲酯，使其成为Fura-2/AM，该变化既增加了酯溶性又消除了负电荷，极大的提高了细胞渗透性。在细胞内，Fura-2/AM被酯酶水解成Fura-2后可与胞浆游离Ca2+可逆性结合。
产品性质
运输和保存方法
冰袋运输。-20℃避光干燥保存。
注意事项
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
需要试剂准备
1） （可选）配制Pluronic F-127母液：100mg Pluronic F-127粉末（Cat No. 60318ES60）中加入0.5ml DMSO，配制成20%(w/v)的DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不要冷藏。如果有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。
2）Hanks•balanced salt solution（HBSS,不含Ca2+, Mg2+）（Cat No. 60161ES76）
使用方法
1）Fura-2/AM储存液的配制
利用高质量无水DMSO溶解Fura-2/AM配制成1-5mM的储存液，该储存液可分装于-20℃避光干燥密封保存。每次使用前需回温至室温。
【注】：① 因为Fura-2/AM在水中的溶解性和稳定性较差，不可用水溶性缓冲液配制Fura-2/AM储存液。
② 溶解用的DMSO需要保证新鲜无水，否则将会导致AM 体水解，使荧光染料无法进入细胞，影响实验效果。
2）Fura-2/AM工作液的配制
利用合适缓冲液将Fura-2/AM稀释成1-5μM的工作液，具体稀释方法如1 mM母液配制1 ml浓度为4 µM工作液，用1 ml 缓冲液稀释4 µl 1mM母液即可，混匀。
【注】：① 典型工作液浓度为0.1-5μM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。
② Fura-2/AM工作液需现配现用，避免反复冻存。
3）（可选）如果Fura-2/AM进入细胞的效果不好，可向 Fura-2/AM/DMSO 溶液中加入适量20% Pluronic F127溶液，最终稀释至其终浓度为0.04-0.05%，Pluronic F127 可以防止 Fura-2/AM在缓冲液中聚合并能帮助其进入细胞。
【注】：Pluronic F127可降低Fura-2/AM的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议将其加入储存液长期保存。
4）取出预培养的细胞，除去培养基，使用缓冲液洗涤细胞3次。
【注】：如果使用含血清的培养基，血清中的酯酶会分解 AM 体，从而降低Fura-2/AM进入细胞的效果。另外含有酚红的培养基会使本底值略微偏高，所以加工作液之前需尽量去除培养基残留。
5）将 Fura-2/AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。在37℃培养15-60min，然后除去Fura-2/AM工作液。
【注】：关于孵育的时间，如果首次做实验不能确定，建议先孵育30min，看荧光效果：如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。
6）用缓冲液洗涤细胞 3 次，以充分去除残留的Fura-2/AM工作液。然后加入缓冲液覆盖细胞。
7）37℃培养箱孵育约 20-30min，以确保 AM 体在细胞内的完全去酯化作用。
8）数字成像显微镜检测细胞。
【注】：① 某些细胞会将荧光探针被动运输或分泌到胞外，在一些通过阴离子泵泄漏探针的细胞内该现象尤其严重，此时需加入一些抑制剂防止该情况的发生，如加入适量的***或磺吡***。但需注意，抑制剂的加入量必须经过优化，过量的抑制剂也会对细胞造成不利影响。
② 某些细胞具有自体荧光会影响结果分析，需使用未加载探针细胞做对照，在结果分析时在同一波长下扣除自荧光。
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