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葡聚糖凝胶G-25
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琼脂糖凝胶6FF 索莱宝产品内容：
提取液：液体110mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1瓶（棕色），-20℃避光保存。临用前加入16mL蒸馏水，充分溶解。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入2mL蒸馏水，充分溶解。
产品说明：
L-半乳糖途径是合成AsA的主要途径。Gal LDH位于线粒体内膜，负责催化植物体内AsA生物合成的最后一步，也是该途径的关键酶之一，对植物体内AsA含量的积累起着至关重要的作用。
Gal LDH催化L-半乳糖内酯还原氧化型细胞色素c（Cyt c），还原型Cyt c在550nm有吸收峰；测定还原型Cyt c增加速率，来计算Gal LDH活性。
自备仪器和用品：
台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量比色皿/96孔板、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、粗酶液提取：
称取约0.1g样品，加提取液1mL，冰上充分研磨，13000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测。
二、Gal LDH测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到550nm，蒸馏水调零。
2. 按样本数取出一定量的试剂一在37℃水浴锅中预热30 min以上，其余的分装保存(-20℃)。
3. 空白管：依次在微量比色皿/96孔板中加入20μL蒸馏水160μL预热的试剂一和20μL试剂二、，迅速混匀后于550nm比色，记录10s和130s的吸光值。
4. 测定管：依次在微量比色皿/96孔板中加入20μL上清液、160μL预热的试剂一和20μL试剂二，迅速混匀后于550nm比色，记录10s和130s的吸光值。
三、Gal LDH活性计算：
a.使用微量比色皿测定的计算公式如下
Gal LDH活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟还原1μmol Cyt c为1U。
（1）按蛋白浓度计算
Gal LDH（U/mg prot）=[(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T
=0.289×(△A测定管-△A空白管) ÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
Gal LDH（U/g 鲜重）=[(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W)÷T
=0.289×(△A测定管-△A空白管) ÷W
ε：还原型Cyt c摩尔消光系数，17.3×103L/mol/cm；d：比色皿光径(cm)，1cm；V反总：反应体系总体积，0.2mL=0.0002L；106：1mol=1×106μmol；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒；W：样品质量，g；T：反应时间，2min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
Gal LDH活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟还原1μmol Cyt c 为1U。
（1）按蛋白浓度计算
Gal LDH (U/mg prot) = [(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷（Cpr×V样）÷T
=0.482×(△A测定管-△A空白管) ÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
Gal LDH (U/g 鲜重) = [(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W)÷T
=0.482×(△A测定管-△A空白管) ÷W
ε：还原型Cyt c摩尔消光系数，17.3×103L/ mol/cm；d：96孔板光径(cm)，0.6cm；V反总：反应体系总体积，0.2mL=0.0002 L；106：1mol=1×106μmol；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒；W：样品质量，g；T：反应时间，2min。
注意事项：
注意事项：
1、在测定酶活时要注意温度。建议取小烧杯一只装入一定量的37℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃水浴锅中，在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
2、建议两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
3、加入最后一种试剂后需迅速混匀并测定OD值。
