产品内容:
提取液:液体110mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:粉剂×1瓶(棕色),-20℃避光保存。临用前加入16mL蒸馏水,充分溶解。
试剂二:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前加入2mL蒸馏水,充分溶解。
产品说明:
L-半乳糖途径是合成AsA的主要途径。Gal LDH位于线粒体内膜,负责催化植物体内AsA生物合成的最后一步,也是该途径的关键酶之一,对植物体内AsA含量的积累起着至关重要的作用。
Gal LDH催化L-半乳糖内酯还原氧化型细胞色素c(Cyt c),还原型Cyt c在550nm有吸收峰;测定还原型Cyt c增加速率,来计算Gal LDH活性。
自备仪器和用品:
台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量比色皿/96孔板、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、粗酶液提取:
称取约0.1g样品,加提取液1mL,冰上充分研磨,13000g 4℃离心10min,取上清液置冰上待测。
二、Gal LDH测定操作:
1. 分光光度计/酶标仪预热30 min,调节波长到550nm,蒸馏水调零。
2. 按样本数取出一定量的试剂一在37℃水浴锅中预热30 min以上,其余的分装保存(-20℃)。
3. 空白管:依次在微量比色皿/96孔板中加入20μL蒸馏水160μL预热的试剂一和20μL试剂二、,迅速混匀后于550nm比色,记录10s和130s的吸光值。
4. 测定管:依次在微量比色皿/96孔板中加入20μL上清液、160μL预热的试剂一和20μL试剂二,迅速混匀后于550nm比色,记录10s和130s的吸光值。
三、Gal LDH活性计算:
a.使用微量比色皿测定的计算公式如下
Gal LDH活性单位定义:37℃中每毫克蛋白每分钟还原1μmol Cyt c为1U。
(1)按蛋白浓度计算
Gal LDH(U/mg prot)=[(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T
=0.289×(△A测定管-△A空白管) ÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
Gal LDH(U/g 鲜重)=[(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W)÷T
=0.289×(△A测定管-△A空白管) ÷W
ε:还原型Cyt c摩尔消光系数,17.3×103L/mol/cm;d:比色皿光径(cm),1cm;V反总:反应体系总体积,0.2mL=0.0002L;106:1mol=1×106μmol;V样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mL;V样总:提取液体积,1 mL;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL,蛋白质浓度需要另外测定,建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒;W:样品质量,g;T:反应时间,2min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
Gal LDH活性单位定义:37℃中每毫克蛋白每分钟还原1μmol Cyt c 为1U。
(1)按蛋白浓度计算
Gal LDH (U/mg prot) = [(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T
=0.482×(△A测定管-△A空白管) ÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
Gal LDH (U/g 鲜重) = [(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W)÷T
=0.482×(△A测定管-△A空白管) ÷W
ε:还原型Cyt c摩尔消光系数,17.3×103L/ mol/cm;d:96孔板光径(cm),0.6cm;V反总:反应体系总体积,0.2mL=0.0002 L;106:1mol=1×106μmol;V样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mL;V样总:提取液体积,1 mL;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL,蛋白质浓度需要另外测定,建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒;W:样品质量,g;T:反应时间,2min。
注意事项:
注意事项:
1、在测定酶活时要注意温度。建议取小烧杯一只装入一定量的37℃蒸馏水,将此烧杯放入37℃水浴锅中,在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
2、建议两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。
3、加入最后一种试剂后需迅速混匀并测定OD值。