产品名称 | 产品编号 | 规格 | 储存 | 价格(元) |
GSTSep Glutathione 4FF Chromatography Column, 1ML GST标签蛋白纯化预装柱,1ML | 20509ES03 | 1ml | 4℃ | 328.00 |
20509ES08 | 5×1ml | 4℃ | 1348.00 |
基质(Matrix) | 高度交联的4%琼脂糖微球 |
配体(Ligand) | 通过12原子间隔臂偶联的谷胱甘肽 |
孔径(Bead size) | 45-165µm |
载量(Capacity) | >10mg GST protein/ml 基质(40kDa) |
最大压力(PressureMax) | 0.3 MPa, 3bar |
pH稳定范围(pH range) | 3-12 |
储存缓冲液(Buffer) | 20%乙醇 |
问题 | 可能原因 | 推荐解决方案 |
柱子反压过高 | 填料被堵塞 | 清洗树脂。 |
裂解液中含有微小的固体颗粒,建议上样前最好用0.22µm或0.45µm滤膜过滤,或离心去除。 | ||
样品太黏稠 | 样品中含高浓度的核酸,延长破碎时间直至粘度降低,或添加DNaseI (终浓度为5µg/ml),Mg2+(终浓度1mM),冰上孵育10-15min | |
缓冲液太黏稠 | 有机试剂或蛋白稳定试剂(如甘油等)可能会引起反压增高,降低操作流速。 | |
洗脱组分中无目的蛋白 | GST标签蛋白变性了 | 使用温和的裂解条件,实验条件以经验为准。 |
过度的裂解使目的蛋白变性 | ||
目的蛋白聚集产生沉淀 | 在细胞裂解前溶液中加入DTT,终浓度为1-10mM | |
融合蛋白改变了GST的构象,影响了目的蛋白的结合力 | 测定pGEX中GST的结合力,对载体进行超声处理,检测其结合力。如果载体中GST有很高的亲和力,有可能是改变融合蛋白的构象从而降低了GST标签蛋白的亲和力。 | |
降低结合温度至4℃,充分清洗。 | ||
柱子平衡时间太短,目的蛋白不是在pH6.5-pH8.0范围内结合 | 用pH6.5-pH8.0的buffer进行充分的平衡,如PBS. | |
目的蛋白没有完全洗脱下来 | 洗脱体积太少 | 增加洗脱液体积,减小洗脱流速。 |
洗脱液中谷胱甘肽浓度太低 | 增加洗脱液中谷胱甘肽浓度,可尝试用50mM Tris-HCl, 20-40mM还原型谷胱甘肽pH8.0洗脱 | |
低pH影响洗脱 | 在不增加洗脱液中谷胱甘肽量时,提高洗脱液中pH至pH8-9会有改善 | |
增加洗脱液中离子强度,如0.1-0.2M NaCl | ||
洗脱液中谷胱甘肽被氧化 | 使用新鲜配制的洗脱液 | |
加入DTT | ||
非特异性疏水作用影响目的蛋白的溶解和洗脱 | 洗脱液中加入非离子型洗涤剂,如0.1%的TritonX-100或者2%正辛基-β-D-吡喃葡糖苷Tween-20 | |
电泳或western blot检测中发现多条带 | Mr 70000蛋白与目的蛋白一起纯化下来 | Mr 70000蛋白可能是大肠杆菌基因DnaK的产物,可以在目的蛋白中加入50mM Tris-HCl, 2mM ATP, 10mM MgSO4, pH 7.4在37℃加热10min去除。 |
可通过ATP-琼脂糖胶或离子交换来去除目的蛋白溶液中的dnaK蛋白 | ||
GST融合蛋白已经发生降解 | 在裂解液中加入蛋白酶抑制剂,如加入1 mM PMSF | |
可能是蛋白酶对目的蛋白部分降解造成的,可使用蛋白酶缺陷型宿主菌(如lon-或ompT) | ||
细胞破碎过度 | 减少细胞破碎时间,超声前加入溶菌酶(菌液体积的0.1倍10mg/ml溶菌酶,25mM Tris-HCl,pH8.0),避免发泡导致蛋白酶变性,过度超声破碎增加宿主内源蛋白与GST融合目的蛋白的共纯化。 | |
共价共纯化 | 包括促进蛋白正确折叠的分子伴侣的共纯化,如:DnaK(Mr~70000), DnaJ(Mr~37000), GrpE(Mr ~40000), GroEL(Mr~57000), GroES(Mr ~10000) | |
抗体与E. coli的各种蛋 白反应 | 抗体吸附E. coli蛋白:GST-抗体;超声处理去除GST抗体,可以用Western Blot检测 |
20507ES10 | GSTSep Glutathione Agarose Resin 谷胱甘肽琼脂糖树脂(用于GST标签蛋白纯化) | 10ml | 928.00 |
20507ES50 | GSTSep Glutathione Agarose Resin 谷胱甘肽琼脂糖树脂(用于GST标签蛋白纯化) | 50ml | 3848.00 |
20507ES60 | GSTSep Glutathione Agarose Resin 谷胱甘肽琼脂糖树脂(用于GST标签蛋白纯化) | 100ml | 6898.00 |
20508ES10 | GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF 谷胱甘肽高速纯化树脂(用于GST标签蛋白纯化) | 10ml | 1238.00 |
20508ES50 | GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF 谷胱甘肽高速纯化树脂(用于GST标签蛋白纯化) | 50ml | 4568.00 |
20508ES60 | GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF 谷胱甘肽高速纯化树脂(用于GST标签蛋白纯化) | 100ml | 7928.00 |
20510ES08 | GSTSep Glutathione 4FF Chromatography Column, 5ML(GST标签蛋白纯化预装柱,5ML) | 5ml | 938.00 |
20510ES25 | GSTSep Glutathione 4FF Chromatography Column, 5ML(GST标签蛋白纯化预装柱,5ML) | 5×5ml | 3928.00 |