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MALBAC技术与Rubicon构建一个高度可重复的单细胞文库WGA单细胞全基因组扩增试剂盒
构建一个高度可重复的单细胞文库
Rubicon Genomics （RB3050/R30050） PicoPLEX WGA Kit 单细胞全基因组扩增试剂盒
The ability to amplify DNA to yield a highly reproducible library from a single cell is now possible! The PicoPLEX WGA kit with patented technology* is designed and optimized for amplification of single copy genomic DNA starting with a single cell. The easy-to-use single tube protocol reduces handling errors, dramatically improves time to results and reduces background. PicoPLEX WGA Kit can be also be used with isolated gDNA amounts ranging from less than 6 pg to 50 pg. Accepted for use in array CGH analysis as well as PCR.
PicoPLEX WGA Kits are used and trusted by leading providers in the IVF community such as BlueGnome for pre-implantation genetic screening and diagnostics (PGS/PGD).
单细胞全基因组PGS/PGD诊断的金标准
This assay involves removing a polar body from a fertilized egg or single cells from five to ten embryos on day 3 post fertilization. After the cells are lysed, the released DNA is then amplified and the amplification product labeled and hybridized to a microarray containing genomic targets.Software analysis identifies copy number variations. PicoPLEX WGA technology has become the standard DNA amplification technique for PGS due to extreme robustness and reproducibility 极强的稳健性和重复性. The same PicoPLEX WGA technology can also be applied to genetic characterization of any single cell sample or picogram quantities of isolated DNA.
Overview
Pre-implantation genetic screening and diagnosis (PGS, PGD) refers to testing done to an embryo or oocyte as a part of an in vitro fertilization (IVF) procedure to select embryos that do not have chromosomal disorders or carry familial disease alleles, increasing the chance of successful pregnancy and decreasing the risk of passing on certain genetic disorders. Microarray analysis is the most common PGS technique performed in IVF clinics, and several kits that contain PicoPLEX technology are widely available. These include Illumina’s 24Sure Arrays, Perkin Elmer’s KaryoLite BoBs developed for PSG and Oxford Gene Technology’s CytoSure? Arrays. Labs are increasingly turning to low pass NGS for these assays and PicoPLEX DNA-seq was developed to fill this need.
Workflow
PicoPLEX Technology
PicoPLEX uses random primer extension with non-complementary primers to yield a library with a high systematic bias and very low stochastic bias.
微量DNA的金钥匙：单细胞全基因组扩增试剂盒 三步法精准可靠 Rubicon Genomics （RB3050/R30050） PicoPLEX? WGA Kit Whole Genome Amplification from Single Cells
Rubicon Genomics成立于2000年，总部位于美国密歇根州。该公司的核心竞争力产品包括酶学、核酸化学、样品的加工生产，该公司致力于创新、知识产权的发展和持续的产品开发。
Rubicon Genomics开发创新、高品质的、核酸文库的制备及配套产品，能够对临床样本进行简单、快速可靠和高灵敏度的分析。
美国Rubicon Genomics---单细胞测序文库构建的领导品牌
1. 二代测序建库试剂（微量起始样品 50pg - 50ng）
2. 单细胞扩增和单细胞测序建库试剂（广泛应用于生殖领域，是该领域的金标准。）
3. 全RNA扩增试剂（微量起始样品，可以低至10个细胞的总RNA）
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【产品介绍】
Rubicon Genomics （RB3050/R30050） PicoPLEX WGA Kit 单细胞全基因组扩增试剂盒
是应用于一般用途的Illumina下一代测序（NGS）的高性能文库，ThruPLEX的DNA测序试剂盒具有较低的和更广泛的输入范围。PicoPLEX? WGA Kit 单细胞全基因组扩增试剂盒具有较低的和更广泛推荐的输入范围比其他工具包。对于Rubicon Genomics 的PicoPLEX? WGA Kit 单细胞全基因组扩增试剂盒样品输入量为20倍，比其他套件更为敏感，从第50和50纳克，不需要协议或适配器浓度的优化。索引和适配器附带套件。
PicoPLEX WGA Kit高性能的最低输入：50 PG 50纳克
PicoPLEX WGA Kit完整的包，用于创建库：优化索引和适配器试剂，酶，缓冲剂，和无核酸酶水
PicoPLEX WGA Kit 其操作仅在一个管3步骤和仅约2小时，没有必要调剂
【产品性能】
Rubicon Genomics （RB3050/R30050） PicoPLEX? WGA Kit 单细胞全基因组扩增试剂盒
Amplification of Single Cells is Reproducible
Flow-sorted cancer cells were amplified with the PicoPLEX WGA Kit. Each of the cells (blue lines) amplified at the same rate, and resulted in a similar, predictable yield. The sample containing 0 cells (green lines; no template control) shows very low background.
扩增单个细胞是可重复的
流分类的癌细胞用PicoPLEX WGA Kit 单细胞全基因组扩增试剂盒扩增。每个细胞（蓝线）以相同的速率扩增，并导致类似的，可预测的产率。包含0个单元格（绿线，没有模板控制）的样本显示非常低的背景。
单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项技术，其原理是对分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序，广泛应用于癌症研究、胚胎发育、辅助生殖、细胞分化、免疫机制、微生物等方向的研究。
获得高覆盖度高保真性的全基因组扩增产物是准确全面的测序结果的保障。为了保证基因组高覆盖度无偏好性的扩增，在单细胞测序技术诞生的近二十年时间里，全基因组扩增技术经历了几次重大的变革，WGA主要有三种方式：DOP-PCR，MDA，MALBAC。下面小编就来为大家介绍一下WGA技术的演变历程，以及怎样根据实验目的选择相应的扩增方式。
DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide–Primed Polymerase Chain Reaction)
技术原理：简并寡核苷酸引物PCR，引物的3 含6bp的随机序列，可以随机的和基因组DNA结合，从而实现对全基因组的扩增[1]。
应用范围：因为PCR的指数扩增特性，放大了基因组上不同序列之间的差异，因而导致扩增出的基因组覆盖度较低。尽管如此，在1M bin size的水平上，DOP-PCR适合对染色体的CNV进行定量。
MDA技术原理：2001年由Laskin团队发明，使用随机的六聚体引物和φ29DNA聚合酶进行反应，该聚合酶具有很强的链置换特性，能够在等温的条件下，扩增产生50~100kb的DN**段。同时由于其3’-5’核酸外切酶活性和校对活性，φ29 DNA聚合酶具有很高的复制保真性[2]。
应用范围：MDA法比DOP-PCR拥有更高的基因组覆盖度，φ29 DNA聚合酶的高效率及高保真性，使得MDA法在对SNV的分析，以及构建大片段文库上有着显著优势。但是，和DOP-PCR相同，MDA法依然是指数扩增，因此依然存在PCR反应的序列偏好性，然而，和DOP-PCR不同的是，这种偏好性并不能重复，因此MDA法不适合进行CNV的分析。商品化试剂盒代表：Qiagen, REPLI-g Single Cell Kit。
MALBAC技术原理：2012年由谢晓亮团队发明，拟线性的扩增过程降低了指数扩增的序列偏好性。扩增引物的5’含有27bp的共同序列，3’是8bp的随机序列，可以和模板在15~20℃的低温下结合，经过8~12个循环的拟线性扩增后，再对这些环状的扩增子进行指数扩增[3]。
应用范围：MALBAC法的优势在于，虽然它依然存在一定的序列偏好性，但和MDA不同，MALBAC的这种偏好性在不同的细胞之间是可重复的，因此可以通过对参考细胞标准化后，进行CNV的分析；另外，由于其扩增的均一性，MALBAC法扩增的等位基因敲除率更低。MALBAC的弱点在于，它使用的聚合酶保真性不如φ29，因此MALBAC在检测SNV时将会出现更多的假阳性；另外，由于它可重复性的序列偏好性，基因组上低扩增的区域有时会在扩增过程中丢失。商品化试剂盒代表：Yikon, Single Cell Whole Genome Amplification Kit; Rubicon, PicoPLEX WGA Kit。
由上述的分析可见，MDA和MALBAC各有优劣，实际上在不同的文献中，研究者也会根据研究目的的不同，采取不同的方式对基因组进行扩增，以满足研究的需要[5-7]。
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