过表达载体构建

人Oct-4过表达载体构建

摘要：以人cDNA为模板扩增Oct-4基因并构建入慢病毒载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro。该载体骨架中EGFP-3FLAG与目的基因融合表达以利于后续的表达观测和Western Blot研究，而puromycin抗性基因则利于稳定细胞株的筛选。该载体既可用于瞬时转染细胞，也可以包装成慢病毒用于稳定株的筛选以及在动物水平过表达Oct-4基因。关键词：Oct-4，过表达，EGFP-3FLAG， puromycin， lentivirus vector

一、 实验原理PCR扩增Oct-4基因序列，构建于pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro载体CMV-EGFP序列间的EcoR I多克隆位点，目的基因和EGFP-3FLAG序列融合表达。pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro载体图谱如下：

二、 实验目的构建既可用于瞬时转染又可用于慢病毒包装和稳定株筛选的Oct-4基因过表达慢病毒载体。

三、 实验方法PCR扩增的Oct-4基因序列与经EcoR I酶切后的表达载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro片段同源重组后转化E.coli  DH5α感受态细胞。菌落PCR筛选到的阳性克隆送测序。经验证无误的进行质粒抽提。实验步骤如下： 1. 引物设计：从GenBank中查询目的基因以及上下游的序列，用Vector NTI软件进行引物设计。PCR扩增目的基因：使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的基因，反应体系和条件如下：

          2. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果：目的基因PCR扩增成功后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，通过和DNA Marker的对比，判断目的基因是否扩增成功。3. 胶回收目的基因片段：把目的基因条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。4. 线性化表达载体的制备：用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10 x反应Buffer 5μl，限制性内切酶各1μl，去离子水补足50μl，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。5. 目的基因同源重组到线性化表达载体中：将目的DNA片段和线性化载体以摩尔比2:1加到离心管中进行重组反应：

       混匀后在42℃孵育30min，然后转移到冰上。静置2-3min后取10μl反应液体转化到感受态细胞中。

6. 感受态细胞的制备和转化：DH5α感受态细胞的制备和转化，详见《精编分子生物学实验指南》¬。¬7. 菌落PCR鉴定阳性转化子：挑取平板上长出的转化子重悬于10µl LB培养液中，取1µl作为模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下：

      8. 阳性克隆送测序：菌落鉴定得到的阳性克隆，送测序公司进行测序验证。软件比对测序结果并分析。9. 质粒小提：经测序验证正确的阳性克隆，安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。

四、 实验结果1. PCR扩增目的基因：用正向引物CTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGGCGGGACACCTGGCT（含同源重组序列、EcoR I酶切位点、Kozak序列，并含有目的基因5’端配对序列用于PCR扩增目的基因），反向引物CCATGGTGGCGAATTCGTTTGAATGCATGGGAGAGC（引物说明：含同源重组序列、EcoR I酶切位点，并含有目的基因3’端配对序列用于PCR扩增目的基因）对人cDNA进行扩增，预期PCR产物大小为1126 bp，电泳结果如下：                                                1    2               3     4

1． PCR产物2． DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp2. 表达载体的线性化：用EcoR I对表达载体进行双酶切，胶回收4801bp的载体片段，酶切图谱如下：                                                     1     2

                                                   1． 载体片段2． 1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp3. 菌落PCR鉴定阳性克隆用菌落PCR鉴定转化子，正向引物CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG位于CMV启动子序列中，反向引物pEGFP-N-3   CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG位于EGFP基因的N端序列，阳性克隆得到1287bp的片段，空载体对照得到252bp的片断。电泳结果如下：                                                 1   2    3    4    5   6   7    8    9   10  11

                                               1． 阴性对照（ddH2O）2． 阴性对照（空载体）3． DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp4-11.  挑取的8个转化子接种阳性克隆，保种并分装100μl送测序。经验证序列无误的，抽提质粒。

4. 测序结果分析阳性克隆测序结果表明，和预期序列完全一致。

           五、 参考文献1. F.M.奥斯伯等著，马学军等译，精编分子生物学实验指南（第四版），科学出版社