过表达miRNA构建

hsa-mir-21过表达载体构建

摘要：以人基因组DNA为模板扩增hsa-mir-21前体序列，并构建入慢病毒载体pGIPZ。在该载体中hsa-mir-21前体序列被插入到tGFP以及puromycin抗性基因的3‘UTR区。tGFP利于后续的表达观测， 而puromycin抗性基因则利于稳定细胞株的筛选。测序证实载体构建成功，该载体既可用于瞬时转染细胞，也可以包装成慢病毒用于稳定株的筛选以及在动物水平过表达hsa-mir-21。关键词：microRNA，过表达， hsa-mir-21， puromycin， lentivirus vector

一、 实验原理以人基因组DNA为模板PCR扩增hsa-mir-21基因前体序列，并构建入慢病毒载体pGIPZ中。载体图谱如下：

                                             二、 实验目的构建既可用于瞬时转染又可用于稳定株筛选的hsa-mir-21过表达慢病毒载体。

三、 实验方法以人基因组DNA为模板PCR扩增hsa-mir-21基因前体序列，并构建入慢病毒载体pGIPZ中。表达载体酶切后回收线性化的载体片段。目的基因片段与线性化的载体片段经同源重组后转化E.coli感受态细胞。用菌落PCR鉴定转化子，阳性克隆送测序。测序无误的克隆进行质粒抽提。

1. 引物设计：从GenBank中查询目的基因上下游的序列，用Vector NTI软件进行引物设计。PCR扩增目的片段：使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的片段，反应体系和条件如下：

2. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果：目的片段PCR扩增成功后，进行琼脂糖凝胶电泳检测①，通过和DNA Marker的对比，判断目的片段是否扩增成功。3. 胶回收目的片段：把目的片段条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。4. 线性化表达载体的制备：用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg， 10 x反应Buffer 5μl，限制性内切酶各1μl，去离子水补足50μl，于37℃水浴锅孵育2h以上。酶切产物进行进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。5. 目的片段同源重组到线性化表达载体中：

将目的DNA片段和线性化载体以摩尔比2:1加到离心管中进行重组反应：

 混匀后在42℃孵育30min，然后转移到冰上。放置2-3min后取10μl反应液体转化到感受态细胞中。6. 感受态细胞的制备和转化：DH5α感受态细胞的制备和转化，详见《精编分子生物学实验指南》。7. 菌落PCR鉴定阳性转化子：挑取平板上长出的转化子重悬于10µl LB培养液中，取1µl做模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下：

8. 阳性克隆送测序：菌落鉴定得到的阳性克隆，送公司进行测序验证。软件比对测序结果并分析。9. 质粒小提：测序通过的阳性克隆，安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。

四、 实验结果1. PCR扩增目的片段：用正向引物CAACAGAAGGCTCGAGGATCTTAACAGGCCAGAAATG（引物说明：含同源重组序列、Xho I酶切位点，并含有目的基因5’端配对序列用于PCR扩增目的基因），反向引物ATTCTGATCAGGATCCCTAAGTGCCACCAGACAGAAG（引物说明：含同源重组序列、BamH I酶切位点下划线标记的，并含有目的基因3’端配对序列用于PCR扩增目的基因）对人基因组DNA进行扩增，预期PCR产物大小为339 bp，电泳结果如下：                                                            1      2

1. PCR产物2. DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp

2. 表达载体的线性化：用Xho I和BamH I对表达载体进行双酶切，胶回收约11kb的载体片段，酶切图谱如下： 

                                                  1   2

1. 1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp2. 载体线性化片段

3. 菌落PCR鉴定阳性克隆：用菌落PCR鉴定转化子，正向引物MIR30-F：ATGAGGCTTCAGTACTTTACAG位于目的基因多克隆位点的上游；反向引物WPRE-R：   CATAGCGTAAAAGGAGCAACA位于目的基因下游的WPRE序列中。阳性克隆得到737bp条带，空载体对照得到434bp。电泳结果如下：                                                       1    2      3     4     5    6      7      8     9   10   11

                                                    1.  阴性对照（ddH2O）2.  阴性对照（空载体）3.  DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp4-11.  挑取的8个转化子接种阳性克隆，保种并分装100μl送测序。测序没有问题的，再接种抽提质粒。

4. 测序结果分析黄色荧光标记的是hsa-mir-21的核心片段，红色字体标记的是其上下游基因组序列GTCGGGTCCAGCGATCTGCCATGACTCTCCCTCCACGCGCGTCCGGCCTGACATCGGCAGTTGGTCAGCGATGACGGCGCCGCCGATGGCGTCTGGACCACGCCCGAAGAGCGTCGAAGCGGGACGTGTTCGCCGAGATCGCTCGCGCCATGCCCGAGTGAGCCGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCTTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCTGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAGTTTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGGATCTTAACAGGCCAGAAATGCCTGGGTTTTTTTGGTTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTTTATCAAATCCTGCCTGACTGTCTGCTTGTTTTGCCTACCATCGTGACATCTCCATGGCTGTACCACCTTGTCGGGTAGCTTATCAGACTGATGTTGACTGTTGAATCTCATGGCAACACCAGTCGATGGGCTGTCTGACATTTTGGTATCTTTCATCTGACCATCCATATCCAATGTTCTCATTTAAACATTACCCAGCATCATTGTTTATAATCAGAAACTCTGGTCCTTCTGTCTGGTGGCACTTAGGGATCCTGATCAGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTAAATCACTTTTTTCAATTGGAAGACTAATGCGGCCGGCCATTACTCCGTCTCGTGTCTTGTTGCATATGTCTGCTGGTTTGTTTGATGTTGTTTGCGGGCGGGCCCTATAGTGAGTCGTATTACCTAGGACGCGTCTGGAACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTGTGAAAGATTTACCTGGAAA

五、 参考文献1. F.M.奥斯伯等著，马学军等译，精编分子生物学实验指南（第四版），科学出版社2. Scherr M, Venturini L, Eder M. Lentiviral vector-mediated expression of pre-miRNAs and antagomiRs.Methods Mol Biol. 2010;614:175-185.3. Jia XQ, Cheng HQ, Qian X, et al. Lentivirus-mediated overexpression of microRNA-199a inhibits cell proliferation of human hepatocellular carcinoma. Cell Biochem Biophys. 2012 ;1: 237-244.