hsa-mir-21 TuD RNA封闭载体构建
摘要:设计针对hsa-mir-21的TuD RNA封闭片段。通过分子生物学手段将该封闭片段构建入腺病毒载体(pAdeno-RNAi-U6-CMV-EGFP)的U6启动子下游,该载体可以实现在封闭hsa-mir-21的同时表达绿色荧光蛋白EGFP,便于观察载体工作状态。除了可以直接瞬时转染细胞用于hsa-mir-21的封闭,该载体也可以包装腺病毒, 用于动物水平封闭hsa-mir-21。关键词:TuD RNA,hsa-mir-21封闭, adenovirus vector, EGFP
一、 实验原理
TuD RNA 原理示意图
如图所示,TuD RNA(Tough Decoy RNA)是一个包含两个miRNA互补序列(MBS)的序列。该序列在转录之后会形成如图所示的相对稳定的茎环状结构,并被转运到细胞质中。通过与目标miRNA互补的序列来封闭目标miRNA的功能。表达载体pAdeno-U6-CMV-EGFP图谱如下:
二、 实验目的构建带有EGFP荧光标记的hsa-mir-21封闭(TuD RNA)腺病毒载体。
三、 实验方法TuD RNA-hsa-mir-21为封闭hsa-mir-21序列,以化学合成的TuD RNA-hsa-mir-21基因通过双酶切得到目的基因片段。表达载体酶切后回收线性化的载体片段。目的基因片段与线性化的载体片段连接后转化E.coli感受态细胞。用菌落PCR鉴定转化子,阳性克隆送测序。测序无误的克隆进行质粒抽提。实验步骤如下:
1. TuD RNA的化学合成:从miRBase中查询到hsa-mir-21的序列,并设计其TuD RNA序列,上下游酶切位点分别为Age I和EcoR I,安排化学合成。2. 制备线性化TuD RNA表达载体: 用限制性内切酶对表达载体进行酶切,酶切反应体系为:质粒2μg,10 x反应Buffer 5μl,限制性内切酶各1μl,去离子水补足50μl,于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果,并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来,用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。3. 胶回收目的基因片段:把化学合成的TuD RNA进行酶切得到目的基因片段,用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收,具体步骤参考试剂盒说明书。4. 目的基因连接入表达载体: 将目的DNA片段和线性化载体以摩尔比3:1加到离心管中:
于16℃ 连接过夜,第二天取10μl反应液体转化到100μl感受态细胞中。
5. 感受态细胞的制备和转化:DH5α感受态细胞的制备和转化,详见《精编分子生物学实验指南》。6. 菌落PCR鉴定阳性转化子:挑取平板上长出的转化子重悬于10µl LB培养液中,取1µl做模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下:
7. 阳性克隆送测序:菌落鉴定得到的阳性克隆,送测序公司进行测序验证。软件比对测序结果并分析。8. 质粒小提:测序通过的阳性克隆,安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。
四、 实验结果1. 酶切获得目的基因片段:用 Age I和EcoR I对化学合成的目的基因进行酶切,胶回收135bp的目的基因片段。酶切图谱如下:
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1. 用 Age I和EcoR I对化学合成的pTuD-NC 进行酶切2. 用 Age I和EcoR I对化学合成的TuD RNA-hsa-mir-21 进行酶切3. 1kb DNA ladder Marker:10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp
2. 表达载体的线性化:用Age I和EcoR I对表达载体进行双酶切,胶回收5.1kb的载体片段,酶切图谱如下:
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1. 线性化表达载体2. 1kb DNA ladder Marker:10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp
3. 菌落PCR鉴定阳性克隆:用菌落PCR鉴定转化子,正向引物hU6-F2:TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG 位于人U6启动子序列中,反向引物pY-SEQR: CTATTAATAACTAATGCATGGC位于CMV启动子的5’序列,阳性克隆得到415bp的片段,空载体得到282bp的片段。电泳结果如下: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1. 阴性对照(空载体)2. DL2,000 DNA Marker: 2 kb, 1 kb,750 bp,500 bp,250 bp,100 bp3-10 挑取的8个转化子接种阳性克隆,保种并分装100μl送测序。经验证序列无误的,抽提质粒。
4. 测序结果分析TuD RNA-hsa-mir-21为封闭hsa-mir-21(hsa-mir-21,UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA)序列,其测序结果如下:GATAAAAATACTTGACTGTAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGTGGCGCTAGGATCATCAACTCAACATCAGTCATCTTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCAACATCAGTCATCTTGATAAGCTACAAGATGATCCTAGCGCCACCTTTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACGCCACCATGGTGAGCAAGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCACTACGCAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACGCAGCTGCCGTGCCCTGACCACCCTCGTGACACCTGACTACGGGTGCATGCTTCAGCCGCTACCGGACAATGAGCACACGACCTCTTCAGTTCGCATGCCGAGGCTACGTCAGGGGCCACCATCTTCTTTCAGGAGACGACGGGGCAACTATCTAGAAA阳性克隆测序结果表明,和预期的序列完全一致,证实该封闭载体构建成功。
五、 参考文献1. Haraguchi T, Ozaki Y, Iba H.Vectors expressing efficient RNA decoys achieve the long-term suppression of specific microRNA activity in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 2009;6-43.2. F.M.奥斯伯等著,马学军等译,精编分子生物学实验指南(第四版),科学出版社