自噬研究利器-LC3双标腺病毒（已发表Cell）

 自噬简介

       细胞自噬(autophagy or autophagocytosis)：又称为Ⅱ型细胞死亡，是细胞在自噬相关基因(autophagy related gene，Atg)的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程。

       比利时科学家Christian de Duve在上世纪50年代经过电镜察看到自噬体（autophagosome）构造，并且在 1963 年溶酶体国际会议上首先提出了“自噬”这种说法。因而Christian de Duve被公以为自噬研讨的鼻祖。Christian de Duve 也因发现溶酶体，于1974年取得诺贝尔奖。

目前根据发生过程分为三类：Macroautophagy，Microautophagy和Chaperone-mediated autophagy CMA)。

大自噬（Macroautophagy）：即我们说的自噬（autophagy）;

微自噬（Microautophagy）：是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成分的一种方式;

分子伴侣介导的自噬 (Chaperone-mediated autophagy，CMA)：一些分子伴侣，如hsp70，能帮助未折叠蛋白转位入溶酶体。通常说的自噬泛指Macroautophagy.

自噬的过程

1）：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，被称为Phagophore。2）：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，全部揽入，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，即“自噬体”。3）：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（这种情况不是必然要发生的）。4）：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。

自噬的调控

1、依赖mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶点）途径的自噬

     1）PI3K-AKT-mTOR信号通路

     2）AMPK-TSC 1/2-mTOR 信号通路

2、其它的信号通路

     1）3-甲基腺嘌呤（3-MA）通过抑制Class Ⅲ PI3K的活性抑制自噬。

     2）beclin1和UVRAG作为正调控子，抗凋亡因子bcl-2作为负调控子共同参与组成Class Ⅲ PI3 复合物调控自噬。

     3）GTP结合的G蛋白亚基Gαi3抑制自噬；GDP结合的Gαi3蛋白活化自噬。

     4）死亡相关蛋白激酶（death-associated protein linase,DAPK）和DAPK相关蛋白激酶（DAPK-related protein kinase-1,DRP-1）诱导自噬。

     5）PKA、casein激酶 Ⅱ、MAP激酶、calcium途径也在自噬错综复杂的调控网格中，但其机制还不甚清楚。

自噬与疾病

1、自噬与代谢

     自噬能清除不正常构型的蛋白质，并消化受损和多余的细胞器，是真核细胞中广泛存在的降解/再循环系统。在细胞新陈代谢、结构重建、生长发育中起着重要作用。在饥饿和新生儿早期，自噬作用明显加强，自噬体显著增多。

2、自噬与肿瘤

     细胞自噬与肿瘤的关系十分复杂，目前尚未完全阐明。一方面，正常细胞自噬增强，可表现出抑制肿瘤发生的功能；与此相反，抑制细胞自噬有潜在的致瘤可能。另一方面，肿瘤细胞也可通过增强细胞自噬来对抗由缺氧、代谢产物、治疗药物诱导的应激反应。

汉恒自噬产品与服务

自噬抑制剂

1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂2）Bafilomycin A1：质子泵抑制剂3）Hydroxychloroquine（羟氯喹）

自噬相关抗体

1）A14292,Premo自噬TB/ GFP TR-FRET LC3B抗体试剂盒

2）Anti-MAP1A/LC3A/B 自噬微管相关蛋白轻链3抗体

3）Anti-MAP1LC3A(microtubule-associated protein 1 light chain 3)  自噬微管相关蛋白轻链3抗体

4）兔抗人、大、小APG4B细胞自噬相关抗体 Anti-APG4B/AUTL1

5）自噬微管相关蛋白轻链3抗体 Anti-MAP1LC3A

6）Anti-SQSTM1 / p62 antibody

汉恒生物已开发并完善了多套自噬相关的研究体系和工具,并积累了丰富的自噬研究经验

汉恒独家推出双荧光LC3细胞自噬腺病毒 

                                                                     双荧光指示体系：汉恒生物科技（上海）有限公司已开发出用于产品。

       mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP 荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。

       我们在显微镜成像后红绿荧光merge后通过merge后出现的黄色斑点即只是自噬体.红色的斑点指示自噬溶酶体,通过不同颜色斑点的计数可以清晰的看出自噬流的强弱。

如下图:细胞转染mRFP-GFP-LC3病毒后给予氨基酸剥夺处理2小时后出现明显增强的自噬以及自噬流。

红色斑点是自噬溶酶体（mRFP），黄色斑点是自噬体（RFP+GFP）. 通过不同颜色斑点的计数可以清晰看出自噬流的强弱，实时监测自噬发生过程，准确，清晰，直观！

参考文献

1、Histone deacetylase 4 selectively contributes to podocyte injury in diabetic nephropathy；

    (Kidney International , (9 April 2014) | doi:10.1038/ki.2014.111)

（2014年发表于Kidney International，2013年影响因子7.916，通讯作者E-mail： fanyi@sdu.edu.cn）