货号: | K10020F |
供应商: | 弘业新创抗体技术股份有限公司 |
规格: | 1mL |
镍离子琼脂糖凝胶6FF预装柱柱料说明
配基:金属镍离子
颗粒大小:90 μm(平均)
吸附载量:不小于25 mg 测试蛋白(15kD)/ml柱料
最大流速:500 cm/h
最高耐压:0.3 MPa
pH稳定性:3~13(长时间);2~14(短时间)
使用温度:常温
保存于20%乙醇溶液中
样品要充分溶解,避免出现堵塞现象,可以利用0.45μM滤膜过滤杂质。溶解样品的缓冲液最好与柱层析用的缓冲液一致,如20mM磷酸缓冲液或PBS(可以含有0.1M-0.5M NaCl)。
上柱前准备
平衡预装柱:
1.将预装柱用合适的乳胶管线连接至层析纯化的泵和检测器上,适当冲水,以检查预装柱各连接处是否漏水
2.用不小于5倍柱料体积的去离子水冲洗预装柱,以彻底除去保存液中含有的乙醇
3.用不小于5倍柱料体积的上样缓冲液平衡预装柱,至流出液pH值稳定达到上样缓冲液的pH值
上样纯化:
1.上样:将含多聚组氨酸标签的蛋白粗样上样至装填好的层析柱中,控制流速不要太快,以保证良好的结合效果。同时收集流出液(流穿)待后续分析。
2.洗杂:用上样缓冲液或洗涤缓冲液清洗层析柱,以洗涤非特异结合的杂质,可以收集洗杂流出液待后续分析。
3.洗脱:两种方法
方法1.降低pH洗脱(一步或者分步),大部分蛋白溶解于pH4-6。可选择柠檬酸盐,磷酸或者乙酸盐为洗脱缓冲液。逐步或一步降低pH至4,收集洗脱流出液
方法2.逐步提高咪唑的浓度(0-0.5M),以上样缓冲液中加入不同浓度的咪唑溶液为洗脱液,分步洗脱结合的蛋白,收集洗脱流出液
4.再生: 分常规清洗和彻底再生
a.一般在每次做完层析纯化后进行常规清洗
1.含0.5M咪唑缓冲液洗柱5个体积
2.去离子水洗柱5个柱体积
3.1M-2M NaCl洗柱5个柱体积
4.去离子水洗柱5个柱体积
5.0.5M NaOH洗柱5个柱体积
6.去离子水洗柱5个柱体积
b.层析柱在使用多次,一般5次以后就可以进行一次彻底再生
1.洗脱完样品的层析柱用0.05M EDTA,0.5M NaCl来洗涤3个柱体积,以彻底脱去镍离子
2.用3个柱体积的0.5M NaCl来洗干净EDTA
3.用3倍柱体积2M NaCl,反向洗脱层析柱
4.用1M NaOH洗涤30分钟
5.用5倍柱体积70%乙醇洗涤层析柱,或者先用含0.1-0.5%非离子去垢剂的0.1M乙酸溶液洗涤30分钟,然后再用5个柱床的70%乙醇去除去垢剂
6.最后用去离子水将层析柱洗涤干净。(以上每一洗涤步骤之间也可以用3倍体积去离子水洗涤一次)
c.使用预装柱时,为了避免死体积太大,可将预装柱中上层保护液吸出,留一厘米左后的液体,将AKTA纯化系统或中压纯化系统中的气泡排净,选择合适管路与之相连,保证预装柱内无气泡。装好之后,先用纯化水洗5~10个柱体积,再用缓冲液平衡5~10个柱体积,具体洗涤步骤按实际要求选择。
1.样品不挂柱
----如果发现目的蛋白不挂柱,而是出现在上样流穿液中,应先验证表达的目的蛋白是否含有多聚组氨酸标签;
----检查pH和缓冲液成分,升高pH可提高结合能力,避免溶液中有EDTA加入;
----检查上样缓冲液中咪唑浓度是否过高,咪唑浓度一般不要超过10mM。
2.洗脱液中不含目的蛋白或者含量很低
----电泳检查目的蛋白表达量,看看目的蛋白表达量是否过低,如果是的话,通过优化条件或更换表达体系提高表达量;
----也可能是柱体积相对过大或上样量太少,可加大上样量;
----观察目的蛋白是否有降解,如果有可以加蛋白酶抑制剂。
3.洗脱产物中有多条杂带
----杂蛋白也可能含有与Ni离子结合的氨基酸残基,如组氨酸、半胱氨酸等,但这些结合都比多聚组氨酸(如His6)的结合弱,用咪唑浓度梯度或者pH值梯度洗脱有可能将不同结合强度的蛋白分别洗脱下来,从而达到分离目的蛋白和杂蛋白的目标;
----另外,镍离子螯合亲和层析填料具有较强的离子效应,在整个纯化溶液体系中加入100mM-500mM NaCl可以起到很好的降低因离子效应导致的非特异结合的问题,使得结合的目的蛋白纯度更高;
----杂蛋白与目的蛋白之间还有可能会通过疏水相互作用的结合在一起,共同挂在层析柱料上,这种情况下,可以在缓冲液加入去垢剂(如1%-2%Triton X-100或者2%Tween 20)等以解离杂蛋白与目的蛋白的结合。
4.包涵体表达样品如何纯化
----如果目的蛋白以包涵体形式表达,可以使用6M盐酸胍或者8 M尿素溶解变性包涵体,然后再进行纯化。
5.样品太粘稠
----主要原因是破菌不彻底导致大量核酸的存在,可以继续超声,或者加入适量核酸酶处理15分钟。
6.柱料变为棕色
----主要是指上样过程柱料由浅蓝色变为棕色,这是由于样品中还原剂浓度太高引起的,过高浓度的还原剂将二价镍离子还原为一价金属离子,从而使颜色发生改变。
预装柱产品目录及报价
货号 | 产品名称 | 规格 | 报价(元) |
K10020F | 镍离子琼脂糖凝胶6FF预装柱(手动中压系统用) | 1mL | 150 |
K10020G | 镍离子琼脂糖凝胶6FF预装柱(手动中压系统用) | 5mL | 480 |
必拓生物(Bio-tool)品牌介绍
必拓生物(Bio-tool)是弘业新创抗体技术股份有限公司的生物试剂品牌。必拓生物(Bio-tool)紧密结合市场需求,专注于细胞培养与冻存、抗体检测与蛋白纯化、以及各类分子生物学试剂的研发与生产,目前已有近千种优质产品,应用于科研实验、体外诊断/检测试剂盒开发以及药物开发等领域,且产品品质获得广大用户的一致好评。
弘业新创抗体技术股份有限公司
电话: 010-80726915 18511779761
QQ:2711569587
邮件: sale01@bio-tool.com
网址:www.bio-tool.com
地址: 北京市昌平区中关村生命科学园生命园路29号创新大厦C座301
欢迎关注必拓生物微信
推送更多促销信息及资讯