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宏基因组 de novo测序-派森诺生物
基因合成服务
Genes Down-Regulated During HCC qpc
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整体课题/基金实验服
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细胞库/普通细胞/原代
全基因化学合成
基因调取ORF克隆
miRNA靶点筛选
RS人类疾病的动物模型| 提供商： | 锐赛生物 |
| 服务名称： | 基因组分析检测实验服务 |
| 规格： | 10T/50T |
BSP甲基化检测实验服务
实验原理
DNA甲基化存在于大多数真核生物中，一般发生在CpG双核苷酸中胞嘧啶的5’UTR区，起调控作用。CpG的胞嘧啶大概有80%被甲基化，20%处于基因调控区的CpG岛中。BSP甲基化测序（Bisulfite Genomic Sequencing PCR）的原理通过对基因组DNA进行重亚硫酸盐处理，非甲基化的胞嘧啶被脱氨基而转变成尿嘧啶，在随后的PCR反应中尿嘧啶转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不能被脱氨基，在反应完成时被保留，我们将扩增得到的PCR产物进行TA克隆测序，就可以分析甲基化发生的具体情况。该方法实验结果准确性高，是甲基化检测的金标准。
实验流程
实验结果展示
图1 目的片段PCR扩增电泳图 图2 菌落PCR筛选阳性克隆
图3 三样本的甲基化结果圈点图分析
图中有三个样本，每个样本含 5 个克隆测序结果，共计 15 个测序结果。每个圆圈代表一个CG位点，黑圈 代表甲基化，白圈代表未甲基化；每一行代表一个样本 TA 克隆的一个测序结果，序列中所有的CG位点情况可被被罗列，此例序列中共含有 31 个CG位点。
我司还提供甲基化检测试剂盒，欢迎广大客户前来选购。
甲基化试剂盒产品简介：
DNA甲基化是一种表观遗传修饰，DNA甲基转移酶（Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作为供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化三种状态。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化对人类表观遗传、胚胎发育、基因印记、等位基因失活及肿瘤发生发展都起到重要作用。
EpiMethyTM Bisulfite Conversion Kit 是一款用于DNA快速重亚硫酸盐转化处理的专用试剂。基因组DNA双链变性结链后，在重亚硫酸盐的作用下序列中未甲基化的胞嘧啶（C）转变成尿嘧啶（U），而甲基化的C保持不变。通过后续的各种检测手段，如MSP、BSP、HRM、Pyroseqencing及甲基化芯片等，将甲基化状态的差异转变成DNA序列的差异被检测出来，从而确定基因的CpG甲基化状态。
本试剂盒提供了重亚硫酸盐转化实验所需试剂和DNA纯化回收过程中所需的优化缓冲液，可获得臻于完美的DNA转化效果和回收效率。与其他同类试剂盒相比，具有如下优势：
- 适用于各种样本类型。
- 在3小时内完成富含GC的DNA的完全转化，转化效率高达99.9%。
- 独特的保护剂最大限度地避免DNA降解，保障了后续的检测实验的需求。
- 优化的缓冲液体系能最大限度的提高处理后的DNA回收效率。
- 优化的操作步骤适合多种起始样本和起始量。
常见问题解决方法
| NO. | 实验问题 | 原因 | 推荐解决方法 |
| 1 | 基因组 DNA 电泳条带弱或不见电泳条带 | 样本降解 | 重新抽提基因组 DNA |
| 2 | 无法扩增到目的条带 | PCR 反应条件不佳 | 采用巢氏 PCR 或重新设计 BSP 引物 |
| 3 | TA 克隆后筛选不到阳性克隆 | 阳性克隆率过低 | 优化 TA 克隆条件，提高 PCR 目标片段的回收率，采用质量更好的感受态细胞和 T 载体 |
| 4 | 测序结果中有大量非CpG 岛的 C | 甲基化修饰不完全 | 对待修饰的基因组 DNA 严格定量，按照甲基化修饰试剂盒说明书操作 |
常见Q＆A
1.常见的甲基化测定方法有哪些，优缺点是什么？
| 常见方法 | 优缺点 |
| MSP 法（Methylation-specific PCR，MSP）：重亚硫酸盐处理基因组 DNA，分别设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行 PCR。通过电泳检测 MSP 扩增产物，如果对甲基化 DNA 链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化，反之，说明被检测的位点不存在甲基化。 | 无需挑克隆测序，步骤简单，但对引物设计的要求较高，容易出现 PCR 假阳性，影响实验结果分析 |
| BSP 法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）：重亚硫酸盐处理基因组 DNA，设计 BSP 引物扩增，对 PCR 产物克隆至 T 载体测序，分析 CpG 位点是否发生甲基化 | 可明确样本待测区段每个 CG 位点的甲基化程度；受实验方法和价格因素限制无法高通量 |
| 高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting ，HRM）：重亚硫酸盐处理基因组 DNA，未甲基化的胞嘧啶经 PCR 扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，导致样品中的 GC 含量发生改变，从而导致熔解温度的变化，从而进行分析 | 检测方法高通量，但是无法明确每个 CG 位点的甲基化程度 |
2.BSP 甲基化检测的关键步骤有哪些？
基因组 DNA 的重亚硫酸盐修饰：转化效率高低直接影响实验结果，所以需在实验过程中不断摸索合适的实验条件以确保较高的转化效率；2）BSP 引物设计：我们对每个区段设计一到两对引物，引物位置需尽可能的避开 DNA 中的 CG 位点，必要时需设计巢式引物，以扩增得到目标片段；3）PCR 扩增：对于较难扩增得到的目标片段，需调整 PCR 反应条件
3.为什么 800bp 的目标片段要分成 2 段进行 BSP 甲基化研究？
由于基因组 DNA 被重亚硫酸盐修饰后会发生断裂，平均片段大小在 500bp 左右，所以每次扩增片段大小不能超过 500bp
4.客户问：BSP 甲基化扩增得到的 PCR 产物可否直接测序，为什么需要构建 TA 克隆后测序？
答：由于基因组 DNA 的每个 CG 位点甲基化程度各不相同，C 若未发生甲基化后会修饰成为 U，而 C 若发生甲基化则不变，如果进行 PCR 产物测序就有可能在原有的 C 位点得到双峰图，无法确定甲基化的程度，必需通过回收PCR产物，进行TA克隆，随机挑选5-10个单克隆测序的方式才能计算获得每个CG位点的甲基化程度
5.如何对 BSP 甲基化测序结果进行分析？我们会采用专业甲基化分析软件对各个 TA 克隆的测序结果进行分析，分析过程中可以了解到 1）测序序列与目的序列的相似度；2）C-T 转化效率；3）通过黑白圈点图确认目的片段中每个 CG 是否发生甲基化；4）确认每个 CG 位点发生甲基化的比例
6.怎样确定基因的目标区域来进行甲基化分析呢？
BSP 法甲基化检测首先需要确定甲基化的检测区域，由于甲基化与调控密切相关，因此我们可参考相关文献对已知转录调控区的基因进行甲基化分析。如果转录调控区位置未知，可以通过基因组序列的分析确定该基因的转录起始位点、翻译起始密码位置，并分析 CpG 岛。转录起始位点附近的 CpG 岛是进行 DNA 甲基化分析的首选区域，一般位于启动子或者 5’UTR 区。需要说明的是，预测仅仅是找到可能性大的区域，我们不能保证预测出来的区域肯定是有甲基化的
7.为什么文献报导的甲基化序列不在 CpG 岛中？
答：CG 二核苷酸是发生甲基化位点的主要区域，而 CG 富含区更是甲基化发生几率更高的区域，但是没有明显的 CpG 岛不代表就没有甲基化，甲基化也可能发生在并不密集的 CG 区域
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