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干细胞：间充质干细胞
ChemGel载干细胞水凝
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细胞计数载玻片80816
表达谱测序 转录组| 提供商： | 上海麒盟生物科技有限公司 |
| 服务名称： | 流式细胞术 CBA检测 |
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操作步骤：
制备人可溶性蛋白自由组合试剂标准品
- 将一瓶冻干的细胞因子标准品微球转移至15ml锥形离心管中，标记为最高浓度标准品（2500pg/ml）；
- 用4ml Assay Diluent 稀释标准品，室温平衡至少15分钟；
- 用枪头轻柔混匀标准品；
- 取9支12x75mm流式管，分别标记梯度稀释倍数1：2，1：4，1：8，1：16，1：32，1：64，1：128，1：256；
- 每管加入500 μl Assay Diluent；
- 从最高浓度标准品开始逐个加入500 μl倍比稀释液，梯度稀释标准品，如下图所示：（从最高浓度标准品管取500 μl溶液至1：2管，吹打混匀，随后从1：2管取500 μl溶液至1：4管吹打混匀，依此类推，直至1：256管）
- 最后取1支12x75mm流式上样管中加入500 μl Assay Diluent作为阴性指控管（0pg/ml）。
- 确定BD CBA 人可溶性蛋白自由组合试剂的数量（即自由组合的细胞因子的种类）；
- 确定试验样本数；
- 混合前每种捕获微球需Vortex充分振荡混匀至少15秒；
- 按照50μl/样本确定试验中所需稀释的捕获微球总量；
- 按照1 μl/样本确定每种捕获微球的体积；
- 确定捕获微球稀释液的体积：捕获微球稀释液的体积=稀释的捕获微球总量-捕获微球体积；
- 将捕获微球与捕获微球稀释液混匀于一管中，标记“混合捕获微球” 。
- 确定BD CBA 人可溶性蛋白自由组合试剂的数量（即自由组合的细胞因子的种类）；
- 确定试验样本数；
- 按照50 μl/样本确定试验中所需稀释的PE标记检测抗体的总量。如样本数为35，则检测抗体的体积为35x50 μl=1，750 μl；
- 按照1 μl/样本确定PE标记检测抗体试剂的量。如如样本数为35，则PE标记检测抗体试剂的体积为35 μl；
- 确定PE标记检测抗体稀释液的体积：检测抗体稀释液的体积=稀释的检测抗体总量-检测抗体试剂体积。如检测1种因子：PE检测抗体稀释液体积为 1，750 μl-（35 μl x 1）=1，715 μl；如检测5种因子，PE检测抗体稀释液体积为 1，750-（35 μl x 5）=1，575 μl；
- 用检测抗体稀释液稀释PE检测抗体试剂，混匀于一管中，标记“混合PE检测抗体”。使用前4°C避光保存。
标准品管中每管加入50 μl梯度稀释好的标准品，标准品浓度如下表所示：
| 管号 | 浓度（pg/ml） | 稀释倍数 |
| 1 | 0 | 未稀释（Assay Diluent） |
| 2 | 5 | 1：500 |
| 3 | 10 | 1：256 |
| 4 | 20 | 1：128 |
| 5 | 40 | 1：64 |
| 6 | 80 | 1：32 |
| 7 | 156 | 1：16 |
| 8 | 312.5 | 1：8 |
| 9 | 625 | 1：4 |
| 10 | 1250 | 1：2 |
| 11 | 2500 | 最高浓度标准品 |
- 样本管中每管加入50 μl待测样本（标准品与待测样本）；
- 涡旋混合微球至少5秒钟，每管加入50 μl混合微球，轻柔混匀；
- 室温孵育1小时；
- 每管加入50 μl PE标记的检测抗体，轻柔混匀；
- 室温孵育2小时；（期间进行流式细胞仪的仪器调试）。
- 每管加入0.7 ml洗液清洗样本，200g 离心5分钟；
- 小心吸去上清液，每管加入300 μl洗液重悬微球；
- 仪器调校完毕后立即上机检测（为避免标准品及待测样本中细胞因子降解，尽快上机检测，如有拖延样本置于冰上，但不过夜）。
样本收集完毕（FCS2.0格式）后，用CBA专用分析软件FCAP Array v1.0进行标准曲线绘制及数据分析
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