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整体课题/基金实验服务
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干细胞：间充质干细胞
ChemGel载干细胞水凝
划痕实验／伤口愈合4
细胞计数载玻片80816
表达谱测序 转录组| 提供商： | 上海麒盟生物科技有限公司 |
| 服务名称： | 一站式慢病毒稳转细胞株筛选构建 |
| 规格： | 按具体要求，确定服务价格 |
一站式慢病毒稳转细胞株筛选构建
慢病毒是将含基因的载体转入大部分哺乳动物细胞最有效的工具，转导的慢病毒载体携带基因可以和细胞基因组DNA整合，从而稳定，长期对基因水平进行调控。通过一套高效的高滴度慢病毒生产系统，能应用于大规模慢病毒生产。病毒滴度可高达10E8-E9TU/ML。利用不同的腺病毒载体系统可分别适用于在各类细胞中稳定过量表达、敲减和敲除不同大小的外源基因。
同时，由于大多数公司只销售体外构建的慢病毒，然而由于细胞异质性，往往在用户进行后续细胞实验过程中不能达到感染效率和预期基因表达水平改变。为简便用户在使用慢病毒筛选细胞稳转株时的繁琐过程，以及保障在不同细胞株中具有确定感染和基因改变效率，推出一站式慢病毒稳转细胞株筛选构建服务，针对用户需要进行功能实验的细胞，通过慢病毒载体上的G418或puromycin抗性进行慢病毒稳转细胞株筛选。用户在60-90天内可直接拿到经过表达鉴定的相应慢病毒稳转细胞株。可以广泛用于癌症、肿瘤、代谢性疾病等相关机制研究。
1. 基因过表达慢病毒稳转细胞株 (LentiOE-Stable)
用于上调基因的高纯度慢病毒进行特定稳转细胞株筛选，适用于在各类细胞中稳定过量表达不同大小的外源基因。
1. 目的基因合成和表达载体构建
1） 目的基因合成
2） 选择合适的表达载体，目的基因合成后直接连接构建
3） 测序验证
2. 表达质粒载体
1） 质粒转化细菌扩增
2） 质粒抽提纯化
3） 酶切电泳以及测序再验证
3. 慢病毒包装
1） 试剂：表达载体、慢病毒载体系统、293T细胞和转染试剂
2） 共孵育及收集含病毒上清液
3） 病毒纯化和浓缩
4） 病毒保存（-80℃）
4. 慢病毒感染目的细胞预实验
1） 优化条件：细胞种板密度、病毒最适MOI、是否需要polybrene辅助感染试剂等
2） 荧光观察或者FACS检测感染效率
5. 药物筛选浓度优化
1） 药物浓度梯度
2） 处理48小时后细胞全部死亡的最低药物浓度为后续实验拟用浓度
6. 正式实验
1） 慢病毒感染
2） 荧光观察
3） 药物筛选多克隆细胞稳转株（或者FACS分选表达GFP的细胞）
4） 有限稀释单克隆细胞株筛选及扩大培养
7. 鉴定
1） 荧光拍照
2） 目的基因qPCR检测
3） Flag或目的基因表达蛋白的Western blot检测
| 过表达稳转株 | 基因合成及质粒提取 | 具体价格需要根据目标基因的长度确定，此价格以1500bp为例。 |
| 病毒包装及预实验 | ||
| 稳转株筛选 | 筛选出3个单克隆 | |
| qPCR和WB鉴定 | 目标基因抗体费用已包含，以小包装2500元计算 |
2. 基因敲减慢病毒稳转细胞株 (LentiKD-Stable)
用于下调基因的高纯度慢病毒进行特定稳转细胞株筛选，适用于在各类细胞中稳定抑制同源基因的表达。
1. 选择至少3个不同的靶点，设计shRNAs
2. 合成对应的序列并构建表达载体
3. 后续慢病毒感染细胞及筛选，步骤基本与LentiOE-Stable相同
4. 注意事项
1） 单克隆分析前需要筛选出干扰效率最高的siRNA。经抗药基因初步筛选后，提取RNA以qPCR检测目的基因干扰效率。
2） 筛选出的siRNA再进行单克隆分析，以qPCR检测筛选出干扰率最高的稳转株，再以WB鉴定选出敲减效果最好的稳转株。
3） 需关注细胞存活率和生长状态。某些基因敲减会造成生长缓慢或者致死表型，因此药物筛选会有影响，需要将细胞以低密度种板进行单克隆筛选，或者可选择FACS分选表达GFP的细胞再分析。也可选择可诱导型RNAi表达载体。
| 序列合成及载体构建 | 构建3个不同靶点的shRNA载体 | |
| 敲减稳转株 | 病毒包装及预实验 | 需要筛选出一个最有效的shRNA载体 |
| 稳转株筛选 | 筛选出3个单克隆 | |
| qPCR和WB鉴定 | 目标基因抗体费用已包含，以小包装2500元计算 |
3. CRISPR基因敲除慢病毒稳转细胞株 (LentiCas9-Stable)
使用CRISPR/CAS9技术实现基因敲除的高效慢病毒进行特定稳转细胞株筛选。应用于任何物种基因组特定位点的精确编辑，并进行细胞水平单基因或多基因敲除；结合Cas9技术同时导入针对潜在位点的多个sgRNA，敲除多个基因位点产生突变，模仿疾病的发生，通过改造得到一系列疾病模型；通过修正某些致病基因，可进行单基因遗传病的研究。
1. 选择至少3个不同的靶点
2. Cas9载体构建
3. 慢病毒感染及筛选同前
说明：本项实验重点在于前期序列设计及载体构建。
| 序列合成及载体构建 | 构建3个不同靶点的载体 | |
| Cas9敲除 | 病毒包装及预实验 | 需要筛选出一个最有效的shRNA载体 |
| 稳转株筛选 | 筛选出3个单克隆 | |
| qPCR和WB鉴定 | 目标基因抗体费用已包含，以小包装2500元计算 |
拥有成熟稳定的稳转细胞系筛选平台，技术多样化，并且可以结合客户特殊需求，灵活地定制服务。稳转细胞株无细菌、真菌及支原体污染，其生长状态、活率及目的蛋白表达水平至少20代保持稳定。
服务须知
客户只需提供基因信息。
| 服务项目 | 公司提供 | 交付产物 | 实验 周期 |
| 慢病毒稳转细胞株构建预实验 | 1、待感染的靶细胞系和培养方法 | 1、GFP对照慢病毒的感染荧光图 2、预实验总结 | 2周 |
| 基因过表达慢病毒稳转细胞株 (LentiOE-Stable) 基因敲减慢病毒稳转细胞株 (LentiKD-Stable) CRISPR基因敲除慢病毒稳转细胞株 (LentiCas9-Stable) | 1、慢病毒 2、慢病毒滴度信息 3、待感染的靶细胞系和培养方法 4、western-blot的一抗 5、质粒构建 6、DMEM培养基，RPIM1640培养基 | 1、目的稳转细胞株 2、对照稳转细胞株 3、western-blot/qPCR原始结果 4、详细实验报告 | 6-10周 |
