Alvetex®Strata 6-Well insert×3

什么是Alvetex®支架?

Alvetex® 系列产品是特别针对三维细胞培养设计的高度孔隙化（成孔率>90%），由惰性聚苯乙烯制成，厚度为200µm，孔径约为36-40µm的圆盘状（Disc）支架。

Fig 1. 扫描电镜（SEM）下观察到的Alvetex®支架微观结构
 

Fig 2. Alvetex®三维细胞培养支架系列产品类型一览：Well insert (6-well, 12-well)；Well plate (12-well, 24-well, 96-well, 384-well)；Well insert + Well insert holder in deep Petri-dish；Well insert + Perfusion plate.

为什么选择Alvetex®三维细胞培养支架?

Alvetex®支架为细胞生长提供了一个模拟体内生理条件的绝佳模型，细胞一旦接种到Alvetex®支架，即很容易进入到支架孔隙内并开始生长。所培养细胞在形态、细胞行为、反应特性方面都更接近于体内天然生长细胞。

Figure 3. 传统2D培养体系与Alvetex®三维细胞培养支架培养的成纤维细胞结构（细胞骨架、细胞核）对比。与传统的二维培养相比，三维条件下培养的细胞，细胞形态更生动立体，更接近体内自然状态。

Figure 4. Alvetex®系列三维细胞培养支架培养的4种不同来源的肝细胞。培养细胞经Bouin’s溶液固定、石蜡包埋后切片（10 µm），经两种染料——苏木精和伊红复染后置于光学显微镜下观察。（A）Alvetex® 6-well insert（AVP004）培养的HepG2细胞系（ATCC, HB-8065），40x物镜；（B）Alvetex® 24-well plate（AVP006）培养的Upcyte®肝细胞（Medicyte GmbH）， 20x物镜；（C）Alvetex® 12-well plate（AVP006）培养的冻存大鼠肝细胞（Biopredic Int.），40x物镜；（D） Alvetex® 12-well insert（AVP005）培养的大鼠肝细胞（Abcellute Ltd.）， 40x物镜；

Figure 5. 与传统2D培养体系相比，Alvetex®三维培养支架培养的HepG2细胞系表现出极佳的生长状态：细胞均一性提升，细胞间相互连接紧密度增加，并且开始形成较为复杂的细胞结构如微绒毛（microvilli）等。（A）HepG2细胞系在传统2D培养体系下培养7天的扫描电镜图片；（B）扫描电镜下观察到的于Alvetex® 三维培养支架内培养7天的HepG2细胞系；（C）高倍投射电镜下观察到的使用Alvetex®三维培养支架培养21天的HepG2细胞系，可以观察到微绒毛（microvill）、紧密连接（tight junctions）以及胆小管样结构（bile canaliculi-like structures）。

Figure 6. （左图）使用Alvetex®三维培养支架培养的HepG2细胞系，其细胞活性（MTT法检测）及分泌进入培养基的白蛋白（Albumin）水平显著高于传统2D模式下培养的HepG2细胞。（右图）以不同的接种密度（8x, 32x, and 64x 104 cells per well）将大鼠原代肝细胞接种于Alvetex®三维培养支架内培养24小时，使用钙黄绿素乙酰基甲基酯（calcein AM）/溴化乙锭（ethidium）异源二聚体标记法测定细胞活力，生长于Alvetex®三维培养支架内的原代肝细胞活性亦显著高于2D模式。

Figure 7. 与传统2D培养方式相比，Alvetex®三维培养支架培养的大鼠原代肝细胞在培养48h、72h后诱导产生不同亚型细胞色素氧化酶P450（CYP， CYP-1A2，CYP-2B1，CYP-3A2）的能力显著提升。

Alvetex®3D细胞培养支架操作流程

一、预处理

首先将Alvetex®支架完全浸没于70%酒精内润洗1次，吸弃酒精，PBS润洗支架2次。为了防止支架风干，请将支架浸没于第二次润洗时使用的PBS内，直至需要。

二、包被

为促进细胞粘着，选择合适的coating solution （poly-D or L-lysine，Fibronectin，Collagen I等）包被Alvetex®支架。以poly-D or L-lysine包被为例：吸弃PBS，加入poly-D or L-lysine，500/Well，盖好盖子，室温孵育1小时；

三、接种

将待培养细胞重悬于少量培养基内制成细胞悬液，吸弃培养板内多余的coating solution，然后小心地将细胞悬液转移接种至Alvetex®支架内，为保证最佳培养效果，请将细胞接种至支架最中央的位置。不同规格Alvetex®支架推荐接种密度及接种体积详见表1。

四、孵育

接种完毕后，将培养板的盖子盖上，放置于37℃，5% CO2培养箱内孵育至少30分钟以促进细胞附着到支架上。不同规格Alvetex®支架推荐孵育时间详见表1。

表1. 不同规格Alvetex®支架推荐接种密度、接种体积以及孵育时间

五、培养

孵育结束后，根据所培养的细胞类型、代谢活力等需求不同，轻轻地往培养板的每一个Well里面加入适量的培养基，然后再次置于37℃，5% CO2培养箱内孵育一段时间后，首次换液，之后每隔2-3天换液（据所培养的细胞类型、代谢活力等需求不同，首次换液时间以及换液频率有所不同）。不同规格Alvetex®支架推荐添加的培养基用量详见表2。

六、下游分析

传统2D培养模式下用于分析、检测的标准细胞及分子生物学方法如显微成像、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫荧光、细胞活力检测、蛋白质组学/基因组学定量分析等，同样适用于Alvetex®3D细胞培养支架培养的细胞。

Figure 8. A. CHO-K1细胞分别以0 cells, 0.5 million cells和2 million cells/支架的接种密度接种于Alvetex®支架（AVP002），培养24h后，使用无毒性的0.5 % 中性红染料（Sigma, N6264-50ML）染色并置于显微镜（明场）下观察；B. 人角质化细胞系（HaCaT）于Alvetex®支架培养7天，固定、石蜡包埋、切片后通过免疫荧光技术进行分析：phase contrast (top), blue fluorescent Hoescht 33258 nuclei stain (middle)，Ki67 staining (bottom).

Figure 9. GFP转染的CHO-K1细胞于Alvetex® 支架（AVP004）培养6天，激光共聚焦显微镜下观察到的单一的GFP转染CHO-K1细胞为期3个小时的细胞行为变化：获取图像间隔30min。

Figure 10. HepG2细胞系于Alvetex® 支架（AVP002）培养3天后，分别进行Hoechst 33342 (blue), cytokeratin 8 (green) 和Nile Red (red)标记并在激光共聚焦显微镜下观察。

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