超氧化物歧化酶SOD活性检测试剂盒

试剂盒内含：100 tests
WST^® Solution………..1 ml × 1管             
Enzyme Solution………20 μl × 1管
Buffer Solution…….      11 ml × 2 瓶          
Dilution Buffer……….   10 ml × 1瓶
 
试剂盒内含：500 tests
WST^® Solution………  5 ml × 1 瓶           
Enzyme Solution……   100 μl × 1 瓶
Buffer Solution………   100 ml × 1 瓶          
Dilution Buffer………   50 ml × 1 瓶
 
检测步骤
1） 将20 μl 样品溶液或水加入到每个孔中。
2） 按照表1所示，向各孔中加入WST^® Working solution， Dilution buffer和Enzyme working solution。^a)
3） 在37℃下培养20分钟。^b)
4） 测定450 nm处的O.D.值
a） 由于加入Enzyme working solution后立即会有超氧化物生成，需要用多通道移液器来加Enzyme working solution以缩短时间，减少各孔间的误差。
b） 如果酶标仪具有控温功能，请将温度保持在37℃。
 
抑制率的计算和典型标准曲线
SOD抑制活性(抑制率%)=｛[(Ablank 1-Ablank 3)-(Asample-Ablank 2)]/(Ablank 1-Ablank 3)｝×100
Ablank 1：blank 1的吸光度
Ablank 2：blank 2的吸光度
Ablank 3：blank 3的吸光度
Asample：样品孔的吸光度
 
样品溶液的制备
细胞（贴壁细胞：9×10⁶个，Leukocytes：1.2×10⁷个）
1.  用刮刀刮下细胞，4℃，2,000 g离心10分钟，弃上清。
2． 用1 ml PBS 洗净细胞，随后4℃，2,000 g离心10分钟，弃上清。重复次步骤一次。
3.  在-20℃下放置20分钟，再在37℃水浴10分钟。这个步骤重复两遍使细胞膜破损。
4.  加入1 ml新的PBS，如果必要的话，在冰浴器上用超声降解细胞裂解物（60 W，0.5 s间隔，15分钟）。
5.  在4℃，10,000 g下离心15分钟
6.  移出上清液用PBS稀释，制成样品溶液。
 
植物或者蔬菜（200 mg）
1.  加入1 ml蒸馏水，用带有研磨球的均质器使样品均匀。
2.  用滤纸过滤，将滤液冻干。
3.  测量冻干后的样品重量，然后用0.1 M的磷酸缓冲液（pH 7.4）溶解，制成样品溶液。
 
组织（100 mg）
1.  用生理盐水清洗组织，尽可能将血除去。用纸巾将组织上的水分吸干，然后称重。
2.  加入400-900 μl 蔗糖缓冲液（0.25 M 蔗糖，10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 7.4），用Teflon匀浆机将样品匀浆。如果必要的话，在冰浴器上将样品超声破碎，（60 W，0.5 s间隔，15分钟）。
3.  匀浆后的样品在4℃下，10,000 g离心15分钟，将上清液移入新的试管中。
4.  用蒸馏水稀释上清液，制成样品溶液。
 
茶（抗氧化剂活性检测）
1.  向10 g茶叶中加入60 ml水，静置2.5分钟。
2.  将提取物用滤纸过滤一次，然后再用0.45 μm的过滤膜过滤一次。
3.  将滤液用蒸馏水稀释，制成样品溶液。
 
红细胞或血浆
1. 取2-3 ml抗凝处理后的血液（如最终浓度约为10 U/ml肝素钠）在4℃，600 g，离心10分钟。
2. 用生理盐水稀释上清液，作为血浆样品。加生理盐水至沉淀中，制成等量的悬液。
3. 将该悬液在4℃，600 g，离心10分钟，弃上清液。
4. 加入等量的生理盐水重复步骤3两次。
5. 在沉淀中加入4.0 ml蒸馏水，制成悬液。加入1 ml乙醇和0.6 ml氯仿。
6. 将混合后的液体，盖紧盖子，在4℃用震荡器强烈震荡15分钟。
7. 将混合液在4℃，600 g，离心10分钟，随后将上层的水乙醇层小心移入一支新的试管中。
8. 取出0.1 ml的水乙醇层，将蒸馏水0.7 ml加入到里面。用0.25%的乙醇稀释，制成样本溶液。
 
胞外SOD（EC-SOD）
1. 制备1支0.5 ml的Con A-sepharose 柱，用PBS平衡。
2. 将组织匀浆的上清液过柱，并在室温下静置5分钟。
3. 用总共10 ml的PBS洗柱。
4. 加入1 ml 0.5 M的α-methylmannoside/PBS,收集洗出液。重复5次。
5. 不用稀释，直接用洗出液进行后续的SOD检测。如果SOD的活性足够高，也可以用PBS稀释样品。
 
酒（抗氧化活性检测）
1. 用0.45 μm的过滤膜过滤一次。
2. 用蒸馏水稀释滤液，制成样品溶液。