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光不能用于对小于其波长一半的任何结构进行成像 - 长期以来，这被认为是光学显微镜中的最终分辨率极限。然而，超分辨率显微镜的发展表明，这一规则存在一定的漏洞。通过在不同时间点对单个分子进行成像，它们的确切位置最终可以组合成一个清晰的图像。2014年，诺贝尔化学奖授予了这一理念。从那时起，超分辨率显微镜技术，如STORM和PALM，已成为研究细胞膜中蛋白质组织的常用方法。
令人惊讶的是，许多研究小组发现，几乎所有研究的蛋白质都在细胞膜中形成簇。在他们研究这些蛋白质簇的过程中，TU Wien的研究人员发现了一个意想不到的发现。通常，所谓的簇实际上是单个闪烁的分子，其被计数多次。团队现在在“ 自然方法 ”杂志上提出的一种新方法可以将真实的星团与这些人工制品区分开来。
细胞生物学的现代成像
“对于医学和生物学中的许多重要问题，理解细胞膜的结构至关重要”，来自TU Wien的GerhardSchütz教授领导的生物物理研究小组的Florian Baumgart说。“超分辨率显微镜是研究细胞膜上蛋白质空间排列的理想工具。我们的研究重点是T细胞，它可以识别抗原，因此在我们的免疫系统中发挥重要作用。”
为了将超分辨率显微镜应用于生物样品，蛋白质用荧光分子(所谓的荧光团)标记。在经典荧光显微镜中，单个荧光团不是透明点，而是褪色圆。因此，如果所有这些分子同时亮起，则它们的图像重叠并且关于其精确空间排列的信息丢失。使用化学技巧或特殊照明方案，可以使荧光团在不同时间点点亮。拍摄一系列照片，每个照片上只能看到几个分离良好的荧光团。随后，计算机程序确定每个图像上分子的确切位置。这最终允许从所有确定的单分子位置重建一个高分辨率图像。
神秘的集群
“近年来，各种研究小组已经研究了蛋白质如何在细胞膜上分布。他们一次又一次地发现，几乎所有蛋白质都形成簇，而不是假设随机位置”，Florian Baumgart说。
乍一看，这似乎是合理的。众所周知，在抗原识别过程中，T细胞可以产生稳定的蛋白质簇，即使用经典的荧光显微镜也可以观察到足够大的蛋白质簇。微小的纳米级蛋白质簇被认为是这些较大结构的前体 - 对T细胞的功能非常重要。
Florian Baumgart也一直在寻找这些纳米团簇。但超分辨率显微镜是一个复杂的问题，有许多可能的误差来源。必须仔细评估数据以获得可靠的结果。有时分子可以多次点亮，这很容易被误认为是分子簇。
弗洛里安鲍姆加特说：“我们考虑过如何区分交替发光的分子簇和一个反复闪烁的单个分子”。决定性的想法是改变荧光团的浓度。“在图片中，聚类和单个闪烁分子可能难以区分，但当我们增加荧光团浓度时，分布的统计特性是不同的。” 如果标记的分子确实形成簇，则当使用增加量的荧光标记时，越来越多的分子位置变得可见。但是在群集之间，仍然存在黑暗空间。另一方面，如果它是随机分布的分子点亮几次，荧光分子数量越来越多 最终将覆盖整个表面，而不会在任何特定区域形成簇。
“我们发现我们感兴趣的膜蛋白根本不会形成簇 - 这个理论必须被抛弃”，Florian Baumgart说。“然而，确实存在确实形成聚类的蛋白质的例子。我们可以证明这些蛋白质的图片具有完全不同的统计特性。”这种区分簇与闪烁分子的方法现已发表在“自然方法”杂志上。它有望帮助解释超分辨率数据，并可能成为帮助理解质膜结构组织的重要工具。
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