研究人员首次使用病毒载体处理遗传疾病的动物模型，以提供基因组编辑组件，其中已经纠正了导致疾病的突变。根据宾夕法尼亚大学佩雷​​尔曼医学院的研究人员的一项新研究，该载体向新生小鼠的传递提高了它们的存活率，同时成年动物的治疗意外地使它们变得更糟。该小组于本周在Nature Biotechnology上发表了他们的研究结果。。

“在这种动物模型中纠正出生后引起疾病的突变使我们向实现个性化医疗的潜力迈进了一步，”资深作者，医学博士，医学教授，宾夕法尼亚州孤儿疾病中心主任詹姆斯威尔逊说。 。“尽管如此，我35年的基因治疗生涯告诉我，将小鼠研究转化为成功的人类治疗是多么困难。从这项研究中，我们现在正在调查基因编辑系统，以便在我们调查的下一阶段解决不可预见的问题。成年动物的并发症。“ 威尔逊也是宾夕法尼亚基因疗法计划的主任。

威尔逊实验室将肝脏作为基因编辑的目标，因为他们在使用基于腺相关病毒(AAV)的载体的传统基因疗法的先前工作中解决了该器官中基因递送的问题。然而，AAV的基因替代疗法对于治疗表现为新生儿的肝脏遗传疾病并不理想，因为随着发育中的肝细胞增殖，非整合基因组丢失。

因为威尔逊，共同第一作者，病理学和检验医学研究副教授，合作者Lili Wang博士认为新生儿肝脏可能是使用CRISPR-Cas9(一种RNA)进行AAV介导的基因校正的理想器官。引导基因组编辑技术，使用细菌蛋白Cas9。使用CRISPR-Cas9时，校正的突变将在载体基因组丢失时持续存在。

该假设在由称为鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)的酶缺乏引起的罕见代谢性尿素循环障碍的小鼠模型中进行了测试。尿素循环是一系列六种肝酶，有助于排除体内氨，蛋白质代谢的分解产物。当其中一种酶缺失或缺乏时，氨会在血液中积聚并传播到大脑，从而导致许多问题，包括脑损伤和死亡。

OTC缺乏是尿素循环障碍中最常见的，每40,000例中就有一例出现。突变的OTC基因可导致比正常短，形状错误或根本不产生的酶。负责OTC的基因突变发生在X染色体上，因此女性通常是携带者，而具有突变基因的儿子患有该疾病。

剪切和粘贴

研究小组注射了两种AAV(特别是在Wilson实验室中发现的对肝细胞具有亲和力的AAV8血清型)，一种表达Cas9，另一种表达指导RNA和供体DNA，进入具有OTC缺乏的新生小鼠。

一只AAV通过肝特异性启动子运送Cas9酶，以确保其仅在注射到血液中时在肝细胞中表达。双系统中的另一个AAV运送了一个指导RNA - 一个20碱基的遗传构建块，然后是另一个序列，将Cas9酶引导到肝细胞核内DNA的正确位置。第二个AAV还含有供体DNA模板以校正突变，从而可以由细胞制备正常的OTC蛋白。添加这种供体DNA以实际校正突变使该研究与其他最近的基因组编辑研究结果区别开来，这些研究结果通过删除正常基因的一部分来规避突变。

整个校正系统基本上是一个“剪切和粘贴”功能，“粘贴”阶段的最后一部分依赖于细胞自身的DNA修复机制，将OTC基因再次正确地重新连接在一起。

在新生小鼠中，通过肝细胞中OTC酶的存在测量，AAV系统的注射平均恢复了10%肝细胞中的突变。他们还看到在高蛋白饮食挑战的幼鼠中存活率增加，这使得老鼠的OTC缺陷症状更加严重。

相比之下，超过30%的未经治疗的OTC缺陷小鼠在一周后死亡，其氨水平显着高于其基因得到纠正的OTC小鼠。在处理的小鼠中从肝细胞分离的DNA的深度测序也显示对突变的校正与存活结果一致。

另一方面，使用相同的双AAV系统，成年，8至10周龄的OTC缺陷小鼠的基因校正较低。成年人还表现出正常饲料中蛋白质耐受性降低和致死性高氨血症。三周后，低剂量基因校正的成年小鼠开始死亡，并且违反直觉，给予高剂量的小鼠在注射后9天开始死亡。

“我们对这些结果感到惊讶，但经过一些进一步的调查，我们破译了基因编辑使成年动物的状况恶化的机制，”王说。观察成年小鼠肝细胞中的DNA序列，他们发现具有校正糊状功能的细胞频率仅为1%左右。“这肯定不足以帮助这些成年老鼠，”王说。更有问题，更完全出乎意料的是，许多未校正的基因含有大的缺失，消除了突变OTC基因的残留活性。

纠正基因的第一步是在靠近突变(Cut)的位置通过Cas9产生DNA中断，在供体DNA存在下，该突变在所谓的同源性中设定了突变的校正阶段。定向修复(HDR或粘贴)。“看来HDR在新生肝细胞中比在成人肝细胞中更有效。” 威尔逊说。

在没有HDR的情况下，细胞将使用另一种称为非同源末端连接(NHEJ)的过程修复切割，该过程在其尾迹中留下小的插入或缺失。该团队将切割指向OTC基因的一部分，如果被小插入或缺失扰乱，则不会干扰突变OTC基因的残留功能。这是新生小鼠的情况。

然而，该团队了解到，成人肝细胞中的NHEJ导致更大的缺失，其中一些消除了OTC基因的任何残余功能。对于在许多细胞中破坏剩余基因功能的针对Cut的低速率的低结果的最终结果导致对成年小鼠中蛋白质的较低耐受性。

“ 在成年OTC小鼠中观察到的基因编辑的后果仅限于治疗突变减少但不能消除功能的遗传性疾病，”Wilson解释说。为了在某​​些患有肝病的成年患者中避免这个问题，该团队正在探索创建切割的方法，同时不会引起大的删除，同时驱动更高频率的粘贴。