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加利福尼亚大学伯克利分校的研究人员利用一种称为循环排列的技术，创造了一套名为Cas9-CP的新型Cas9变体，它将简化Cas9融合蛋白的设计，适用于简单DNA切割以外的各种应用，如碱基编辑和表观遗传修改。这项工作将于1月10日发表在Cell杂志上。
通过相同的过程，研究人员将“永远在线”的Cas9分子转变为可激活的开关，这些开关保持在“关闭”位置，直到被称为蛋白酶的酶激活。由此产生的蛋白酶感应Cas9s(ProCas9s)可以减少脱靶效应并实现分子感应，以及组织或器官特异性基因组编辑。研究人员证明，ProCas9s可用于检测病毒蛋白酶，可能作为一种能够引发免疫反应的病原体感应系统。
加州大学伯克利分校的生物化学家，资深作者大卫萨维奇说：“我们并没有坚持大自然给我们的基因组编辑蛋白质。” “这些蛋白质可以精心优化，并变成具有适合人体细胞特性的支架。”
CRISPR-Cas蛋白如Cas9是保护细菌免受入侵病毒的酶。这种细菌防御系统已被重新用于基因组编辑应用，例如在各种细胞类型和生物体中灭活基因。Cas9进化为细菌防御系统，并且它不一定具有哺乳动物细胞中基因组编辑所需的特性，例如基因组靶向的极高准确度和精确度，或控制酶的空间和时间活性的能力。
虽然已构建Cas9融合蛋白以有效编辑DNA中的核苷酸，或通过表观遗传修饰激活或抑制转录 - 在不改变DNA序列的情况下影响基因活性的变化 - 每个新应用都需要深入的工程方法并进行费力的优化。另一个主要障碍是Cas9始终处于“开启”状态。对蛋白质活性缺乏控制使得难以靶向特定细胞或组织，导致无意的基因组编辑和更大的脱靶基因组损伤，并且阻止使用Cas9作为细胞事件的分子记录器。
为了克服这些障碍，Savage和他的团队使用循环排列来重新设计Cas9的分子序列，从而更好地控制其活性并为融合蛋白创建更优化的DNA结合支架。该Cas9重新连接方法涉及将蛋白质的末端(即其N-和C-末端)与肽接头连接，同时在不同位置分裂其序列以产生新的相邻N-和C-末端。
研究人员发现，Cas9对圆形排列具有很强的延展性。蛋白质的几个区域具有可在多个位置打开的热点，以产生多种Cas9-CP，其可用作高级融合蛋白的支架。目前，Cas9的N-和C-末端是固定的，并且它们不是理想地用于融合蛋白以获得DNA。相比之下，新蛋白质支架的末端更靠近蛋白质的DNA相互作用界面，并且被优化用于融合蛋白质的有效构建。
研究人员接下来通过设计肽接头产生ProCas9s，使接头足够短以将蛋白质限制为无活性状态，然后引入可通过匹配病毒蛋白酶切割的序列。然后调整这些ProCas9用作利他防御系统，其可以检测和响应病原体，产生大量DNA损伤并在通过切割接头肽激活时杀死受感染的细胞。
“我可以设想各种生物医学应用，其中Cas9-CP和ProCas9s将使我们能够更好地了解疾病过程，并使CRISPR-Cas基因组编辑和修饰的转化应用更加安全，”加利福尼亚大学的共同第一作者Christof Fellmann说。 ，伯克利。
在未来的研究中，研究人员将致力于开发Cas9融合蛋白用于碱基编辑和表观遗传修饰。此外，他们计划测试ProCas9s是否可用于构建整个合成免疫系统。也可能开发对内源性蛋白酶敏感的ProCas9以靶向特定细胞，例如，编辑癌细胞的基因组。“我们的ProCas9系统在控制Cas9有用的任何情况下都很有用，”Savage说。
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