转运蛋白ABCG2属于ATP结合盒(ABC)家族。蛋白质在多种组织和组织屏障内的细胞质膜中表达，包括血脑，血睾和母胎屏障。蛋白质可由ATP提供动力以转移内源底物，影响许多药物的药代动力学并防止多种异生素，包括抗癌药物，尤其是乳腺癌。ABCG2通常被称为乳腺癌耐药蛋白，其中先前的研究揭示了ABCG2结构和ABCG2抑制的结构基础用小分子和抗体。ABCG2的底物识别机制以及ATP驱动的运输能力仍有待确定。

在现在发表在Nature上的一份新报告中，Ioannis Manolaridis及其同事提出了人类ABCG2的高分辨率低温电子显微镜结构，其基底结合前转位状态和ATP结合后易位状态。科学家使用含有谷氨酰胺的突变蛋白代替催化谷氨酸(ABCG2 EQ)来观察这两种状态。突变体ABCG2 EQ显示降低的ATP酶和转运速率，以使构象捕获适合于结构研究。在研究的底物结合状态中，在面向细胞质的腔中大约穿过膜的一半，整合了单分子的雌酮-3-硫酸酯(E 1 S)用于功能研究。

由于ATP诱导的构象变化，枢转核苷酸结合结构域(NBD)和相对NBD亚结构域方向的变化，观察到跨膜结构域的刚体移位。在其作用机制中，ABCG2利用ATP结合的能量来挤出E 1 S和其他内源底物。基于化合物的大小和结合亲和力，因此可以在研究中区分底物和抑制剂。

转运蛋白ABCG2属于ATP结合盒(ABC)家族。蛋白质在多种组织和组织屏障内的细胞质膜中表达，包括血脑，血睾和母胎屏障。蛋白质可由ATP提供动力以转移内源底物，影响许多药物的药代动力学并防止多种异生素，包括抗癌药物，尤其是乳腺癌。ABCG2通常被称为乳腺癌耐药蛋白，其中先前的研究揭示了ABCG2结构和ABCG2抑制的结构基础用小分子和抗体。ABCG2的底物识别机制以及ATP驱动的运输能力仍有待确定。

在现在发表在Nature上的一份新报告中，Ioannis Manolaridis及其同事提出了人类ABCG2的高分辨率低温电子显微镜结构，其基底结合前转位状态和ATP结合后易位状态。科学家使用含有谷氨酰胺的突变蛋白代替催化谷氨酸(ABCG2 EQ)来观察这两种状态。突变体ABCG2 EQ显示降低的ATP酶和转运速率，以使构象捕获适合于结构研究。在研究的底物结合状态中，在面向细胞质的腔中大约穿过膜的一半，整合了单分子的雌酮-3-硫酸酯(E 1 S)用于功能研究。

由于ATP诱导的构象变化，枢转核苷酸结合结构域(NBD)和相对NBD亚结构域方向的变化，观察到跨膜结构域的刚体移位。在其作用机制中，ABCG2利用ATP结合的能量来挤出E 1 S和其他内源底物。基于化合物的大小和结合亲和力，因此可以在研究中区分底物和抑制剂。

作者首先确定用Walker B基序中的谷氨酰胺替代催化谷氨酸E211(磷酸盐结合序列)将导致突变体大大减少(尽管未消除)ATP水解和E 1 S转运活性。为了确定E 1 S结合结构，将单克隆抗体5D3(5D3-Fab)的抗原结合片段添加到样品中 - 其结合ABCG2的外表面，以促进高分辨率结构测定。在ATP水解减慢通过加入5D3-FAB的抑制脂质体的重建ABCG2的和转运活性，而不会影响ABCG2和E之间的相互作用1小号衬底。ABCG2 EQ 复合物显示出内部开放的构象，总分辨率为3.6，以清楚地显示跨膜结构域和底物结合腔。

作者观察到由ABCG2单体的底物结合腔中的跨膜(TM)螺旋TM2和TM5a形成的密度特征。密度特征可以在两个方向上结合一个E 1 S底物，尽管由于多环体系的空间碰撞，两个E 1 S分子不能同时结合。底物结合腔还可以容纳抑制剂，证明其在底物和多药结合中的双重作用。

在这项研究中，科学家们为ABCG2 EQ -E 1 S 产生了单点突变，以确定所得突变体变体的ATP酶活性和E 1 S转运。所有测试的突变体的稳定性显示与天然野生型蛋白质的相似性，允许直接比较。例如，V546F突变体具有受损的转运活性，但ATP酶活性增加12倍，尽管E 1 S以浓度依赖性方式抑制。该结果表明，将两个苯环引入底物腔中使得能够与底物结合模拟ATP酶活性刺激，但进一步包含E 1S'堵塞了'转运蛋白'。其他突变体变体的结果与研究中的野生型蛋白质相比有所不同，强调了结合腔对修饰的敏感性。

使用低温-EM显微术进行的其他功能研究表明，ATP结合导致NBD(核苷酸结合结构域)的α-螺旋结构域旋转35度以进行二聚化，从而在运输周期中实现“动力中风”。在每个ABCG2单体中，单个跨膜核苷酸结合结构域界面在无核苷酸和ATP结合状态之间保持基本不变。然而，ATP诱导的构象变化引发NBD的变化，导致跨膜结构域(TMD)的细胞质成分彼此推向。这种ATP诱导的构象变化在底物转运途径中具有重要作用。

在结构上处于ATP结合状态的ABCG2 EQ -E I S中，苯环相互堆叠，使基板弯曲腔塌缩而没有空间用于结合的基板。对于穿过膜的运输，基质必须在运输器的中心移动通过易位通路，以在通路完全关闭之前到达外腔。对于该过程，必须发生类似蠕动运动的瞬时构象变化以产生基板的空间。

作者假设底物可以通过细胞质或通过脂质双层内的“膜入口”结合。一旦结合，NBD二聚体只能在基质移出基质结合腔时关闭。在生产性运输周期中，假定基质通过“亮氨酸塞”在运输者的中心移动通过易位途径。一旦底物清除了插塞区域，ATP结合的ABCG2 EQ的结构表明插塞区域闭合，并且底物被释放到外部。

该研究的一个警告是，E211Q突变可能影响了所涉及的构象变化的能量学。该发现表明ATP结合可能足以进行底物挤出步骤，并且转运蛋白可以通过ATP水解重置为面向内的构象。与其他转运蛋白不同，ABCG2似乎在底物结合时不形成稳定的，闭塞的构象，但表现出类似于细菌BtuCD-F转运蛋白的蠕动样机制的瞬时构象。

使用多特异性多药转运蛋白(如ABCG2)仍未解决的一个关键问题是为什么某些化合物作为底物，而其他化合物则作为有效的抑制剂。当作者比较ABCG2底物与两种有效抑制剂的结合模式时，所有三种分子都与转运蛋白的同一腔结合。该研究进一步表明，当底物E I S和ATP一起结合ABCG2时，插塞的开口允许底物被推入外腔。相反，通过将结构锁定在面向内的构象中，抑制剂充当楔子以固定转运蛋白。该研究表明，化合物的大小和结合亲和力对于转运蛋白中的易位是重要的，从而允许区分底物和抑制剂。该工作为进一步了解转运蛋白 ABCG2的动力学提供了新的见解。