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在许多层面上，CRISPR-Cas9基因组编辑技术难以控制。一段时间以来，科学家已经知道细菌已经开发出一种方法 - “抗CRISPR”系统 - 来干扰细胞中的Cas核酸酶功能。现在，Broad研究所开发的高通量检测方法已经确定了第一个小分子“抗CRISPR”，这项工作不仅可以更精确地控制基因组编辑技术，而且可以为进一步研究这些分子奠定基础。
这项名为“鉴定CRISPR-Cas9的小分子抑制剂的高通量平台”的论文中描述的这项研究发表在Cell杂志上。
“这些研究为快速鉴定和使用针对SpCas9和下一代CRISPR相关核酸酶的小分子抑制剂奠定了基础，”Broad研究所的Amit Choudhary博士说。“靶向CRISPR相关核酸酶的小分子抑制剂具有广泛应用于基础，生物医学和国防研究以及生物技术应用的潜力。”
Choudhary及其同事筛选了多种小分子，以鉴定化脓性链球菌Cas9(SpCas9)的小分子抑制剂。为此，他们开发了高通量初级和二级检测SpCas9-DNA结合和SpCas9 DNA切割活性，分别。对于初步测定，他们使用荧光偏振来监测SpCas9和含有PAM序列的荧光团标记的DNA区段之间的相互作用。在二级测定中，他们使用自动显微镜来测量由SpCas9介导的细胞中报告基因的DNA切割诱导的荧光变化。
使用这些分析，该团队确定了两种先导化合物，这些化合物破坏了SpCas9在哺乳动物细胞中以剂量依赖性方式结合DNA并抑制SpCas9介导的DNA裂解的能力。由于它们通过酶阻断DNA结合，因此这些分子还抑制SpCas9的催化受损技术，包括用于转录激活的技术，并且在人血浆中是稳定的。
小分子容易进入细胞并且比先前发现的抗CRISPR蛋白小得多。它们重量<500 Da，具有细胞渗透性，并允许基于SpCas9技术的可逆和剂量依赖性控制，包括其在哺乳动物细胞中的基因编辑，碱基编辑和表观遗传编辑的应用。
尽管存在靶向SpCas9的抗CRISPR蛋白，但它们很大并且对细胞不可渗透，在行动中不可逆转，可被蛋白酶咀嚼，并且可能在体内造成不良免疫反应的风险。相反，小分子抑制剂是蛋白水解稳定的，可逆的，并且通常是非免疫原性的，并且可以通过被动扩散容易地递送至细胞。此外，它们可以低成本大规模合成，几批间差异很小。
目前，SpCas9正在开发作为多种疾病的基因治疗剂，包括HIV，视力障碍，肌肉萎缩症和其他遗传性疾病。但是，这些治疗应用将极大地受益于对SpCas9活性的剂量和时间的精确控制以减少脱靶效应。控制SpCas9活动的这些方面也可以使其他应用受益，例如有效编辑模型生物的DNA以模拟和研究疾病，以及基因驱动在基因工程蚊子工程蚊子中的使用，以遏制疟疾和其他蚊子传播疾病。
“这些结果为CRISPR-Cas9活动的精确化学控制奠定了基础，使得能够安全使用这些技术，”Choudhary说。“然而，这些分子还没有为人类应用做好准备，也没有在生物体内进行功效测试。”
在未来的研究中，研究人员计划在SpCas9：gRNA复合物上鉴定抑制剂的结合位点，检查其作用机制，并优化其效力。他们还将确定分子是否与哺乳动物细胞中的其他靶标相互作用，并评估它们对其他CRISPR相关核酸酶的特异性。细胞论文中包含的早期结果表明，这些分子对其靶标非常特异，因为它们对远缘相关的CRISPR酶Cas12a没有影响。
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