所有分类
约翰霍普金斯大学的科学家们开发了一种简化的方法和伴随的效率“规则”，用于在使用称为CRISPR的基因切割工具后将新DNA序列引入细胞。科学家表示，这种方法基于对小鼠胚胎和数千种人类细胞的测试，可以提高基因组编辑的一致性和效率。新方法及其发展在11月28日的“美国国家科学院院刊”网络版上有所描述。
“CRISPR是一种帮助科学家修改基因组，预测某些特征的结果并研究它们的工具，但该工具本身只会在基因组中产生断裂。它不能控制新DNA序列如何插入基因组中，” Geraldine Seydoux，博士，亨廷顿谢尔顿分子生物学和遗传学系医学发现教授，约翰霍普金斯大学医学院基础研究副主任，以及霍华德休斯医学研究所的研究员。
“我们开始研究细胞如何修复由CRISPR诱导的断裂，目的是利用细胞的天然DNA修复过程在基因组中引入新的序列。我们惊讶地发现细胞很容易从外来DNA复制序列来修复DNA断裂，只要外国DNA是线性的，“Seydoux补充道。“通过研究在修复过程中如何复制外源DNA片段，我们提出了一些简单的规则，使基因组编辑尽可能高效，优化工具，并充满信心地进行。”
作为有效切割DNA的工具，CRISPR在过去五年中在科学家中广受欢迎，它代表着有规律的间隔短回文重复序列。它适用于哺乳动物细胞，来自细菌细胞中的天然病毒防御过程，涉及在病毒DNA中产生致死性切割。从本质上讲，该工具是一套精简的分子“剪刀”。
科学家们普遍认为，细胞通过插入一组随机的核苷酸(DNA的化学构建块)来修复DNA断裂。这通常会破坏位于DNA断裂点的任何基因。
科学家们也熟知，细胞偶尔会使用不同的来源 - 来自另一片DNA的序列，或“供体”DNA来密封DNA的断裂。然而，新的“供体”序列不能自身插入基因组中的空白空间。
相反，新的供体DNA需要在每一端都有一种胶带，以帮助它粘在切口所形成的间隙内。科学家将这种胶带称为供体DNA的“同源”臂。
同源臂由核苷酸组成，所述核苷酸与DNA的完整部分重叠，具有匹配的遗传密码。这有助于供体DNA“粘附”到完整的DNA上。
然而，科学家认为使用供体DNA作为修复基因组的低效方法，假设它需要长同源臂，特别是当插入长DNA序列时，以及难以长尺寸制备的单链或环状DNA。
随着科学家们获得更多的CRISPR经验，Seydoux说，“有关供体DNA的最佳设计规则和同源臂长度的问题出现了。”
为了寻找这些问题的答案，约翰霍普金斯大学的科学家们将供体DNA的各种组合插入到人类胚胎肾细胞中，这些细胞以其良好的生长能力和频繁用于癌症研究而着称。科学家使用供体DNA和一种编码荧光蛋白的基因，当基因插入成功时，荧光蛋白在细胞核膜上发出绿光。
约翰霍普金斯大学的研究员Alexandre Paix发现线性DNA片段作为供体非常有效，并且比人类细胞中的环状DNA(称为质粒)效率高2到5倍。“线性DNA很容易在实验室中使用PCR进行制备，”Paix说，他指的是用于扩增DNA的聚合酶链反应工具。
Paix还测试了不同长度的同源臂。他发现同源臂的最佳位置长约35个核苷酸，比科学家通常使用的短得多。
具体地，发现长度为33至38个核苷酸的同源臂与具有518个核苷酸的同源臂一样成功，在最佳条件下产生10%至20%的成功编辑。相反，当科学家测试长度为15和16个核苷酸的同源臂时，插入成功率下降了一半。他们在人类基因组的三个不同位置重复这些结果。
他们还发现新插入的序列，不包括同源臂，长度可达1000个核苷酸。
该团队的成功率在10%至50%之间，插入片段的长度范围为57至993个核苷酸。较短的序列比较长的序列更成功插入。例如，分别在45.4,23.5和17.9%的时间内成功插入长度为57,714和993个核苷酸的新序列。超过1,000个核苷酸，具有1,122和2,229个核苷酸的新插入物几乎没有成功 - 约0.5%的时间。“在这样的规模下，引入编辑所需的供体DNA数量变得非常困难。细胞倾向于”扼杀“如此多的DNA，”Seydoux说。
最后，研究小组还发现，当新序列位于距离CRISPR切割位点30个核苷酸内时，编辑成功率达到峰值。“超过30个核苷酸，插入是不可行的，”Seydoux说。
“这些参数应该适应科学家正在寻求编辑的大多数基因。事实上，大多数实验只涉及编辑靠近CRISPR切割位点的两到三个核苷酸，”Seydoux补充道。
研究小组还测试了相同的方法是否适用于小鼠胚胎。使用具有36个核苷酸同源臂的PCR片段，该团队成功地将编码荧光蛋白的739个核苷酸长的序列插入到87个(31%)小鼠胚胎中的27个中。
Seydoux的研究团队已经开始使用修复规则来研究线虫Caenorhabditis elegans中的DNA，研究人员正在研究修复规则是否适用于其他类型的人体细胞。
在指南被广泛采用之前，Seydoux说它们应该在更多的人类细胞类型和其他生物中进行测试。
所有评论仅代表网友意见，与本站立场无关。
我要评论