哈佛医学院和康奈尔大学的科学家已经生成了CRISPR的近原子分辨率快照，揭示了其作用机制的关键步骤。该研究结果于6月29日发表在Cell上，为改善CRISPR生物医学应用的效率和准确性提供了必要的结构数据。

通过冷冻电子显微镜，研究人员首次描述了确切的事件链，因为CRISPR复合物加载靶DNA并准备用于切割Cas3酶。研究人员说，这些结构揭示了一个具有多层错误检测的过程 - 一种分子冗余，可以防止意外的基因组损伤。

CRISPR-Cas3是CRISPR-Cas系统的亚型，是生物医学研究中用于精确基因编辑的广泛采用的分子工具。然而，其作用机制的方面，特别是它如何搜索其DNA靶标，尚不清楚，并且对非预期的脱靶效应的担忧引起了对用于治疗人类疾病的CRISPR-Cas安全性的质疑。

这些结构的高分辨率细节揭示了使用CRISPR进行基因编辑时确保准确性和避免脱靶效应的方法。

“为了解决特异性问题，我们需要了解CRISPR复合物形成的每一步，”哈佛医学院细胞生物学助理教授，该研究的共同高级作者廖茂夫说。“我们的研究现在显示了CRISPR如何从初始识别靶DNA和通过构象变化过程捕获入侵DNA的确切机制，这些变异使得DNA可被Cas3最终切割。”

目标搜索

在不到十年前发现，CRISPR-Cas是一种适应性防御机制，细菌用来抵御病毒入侵者。该过程涉及捕获病毒DNA片段的细菌，然后将其整合到其基因组中并产生称为crRNA(CRISPR RNA)的短RNA序列。这些crRNA片段用于发现“敌人”的存在。

像条形码一样，crRNA被加载到CRISPR家族酶的成员上，其执行漫游细菌和监测外国代码的哨兵的功能。如果这些核蛋白复合物遇到与其crRNA相匹配的遗传物质，它们会切断该DNA以使其无害。CRISPR-Cas亚型，特别是Cas9，可以用合成RNA编程，以便在精确位置切割基因组，使研究人员能够以前所未有的方式编辑基因。

为了更好地理解CRISPR-Cas的功能，廖与康奈尔大学的Ailong Ke合作。他们的研究小组专注于1型CRISPR，这是细菌中最常见的亚型，它利用称为CRISPR Cascade的核糖蛋白复合物进行DNA捕获，使用Cas3酶切割外源DNA。

通过生物化学技术和低温电子显微镜的结合，他们在不同的功能状态下重建稳定的Cascade，并进一步生成Cascade的快照，因为它捕获并处理的DNA分辨率高达3.3埃 - 或大约是a的直径的三倍。碳原子。

眼见为实

在CRISPR-Cas3中，crRNA被加载到CRISPR级联上，其搜索称为PAM的非常短的DNA序列，其指示外源病毒DNA的存在。

Liao，Ke和他们的同事发现，当Cascade检测到PAM时，它会以锐角弯曲DNA，迫使一小部分DNA放松。这允许11个核苷酸的crRNA区段与一条靶DNA链结合，形成“种子泡”。

种子气泡充当故障安全机制，以检查目标DNA是否与crRNA匹配。如果它们正确匹配，则气泡扩大并且crRNA的其余部分与其相应的靶DNA结合，形成所谓的“R-环”结构。

一旦R环完全形成，CRISPR级联复合物经历构象变化，将DNA锁定到位。它还在第二个非目标DNA链中产生一个凸起，该链在Cascade复合体上的一个单独位置上运行。

只有当形成完整的R-环状态时，Cas3酶才会结合并切割在非靶DNA链中产生的凸起处的DNA。

研究结果揭示了精确的冗余，以确保精确度，避免错误地切碎细菌自身的DNA。

“为了在人类医学中应用CRISPR，我们必须确保该系统是准确的，并且它不针对错误的基因，”该研究的共同高级作者柯说。“我们的论点是CRISPR-Cas3亚型已经发展成为一个精确的系统，有可能成为一个更准确的系统用于基因编辑。如果存在错误定位，我们知道如何操纵系统，因为我们知道所涉及的步骤以及我们可能需要干预的地方。“

设置景点

已经描述了没有靶DNA并且在其后R-环构象状态的CRISPR级联的结构，但是该研究首次揭示了从种子气泡形成到高分辨率的R-环形成的全部事件序列。

与手术刀样Cas9相比，CRISPR-Cas3就像一台粉碎机，可以将DNA咀嚼到无法修复的状态。虽然迄今为止CRISPR-Cas3对精确基因编辑的实用性有限，但它正在开发作为抗击抗生素抗性细菌菌株的工具。更好地了解其机制可能会扩大CRISPR-Cas3的潜在应用范围。

此外，所有CRISPR-Cas亚型都利用某种形式的R-环形成来检测和制备靶DNA以进行切割。现在，对该过程的改进结构理解使研究人员能够努力修改多种类型的CRISPR-Cas系统，以提高其准确性并降低生物医学应用中脱靶效应的可能性。

“科学家们假设这些状态存在，但他们缺乏视觉证明它们的存在，”共同第一作者Min Luo说，他是HMS辽实验室的博士后研究员。“主要障碍来自于这些状态的稳定生化重建和高分辨率结构可视化。现在，看到真的相信。”

“我们发现这些步骤必须按照精确的顺序进行，”罗说。“从进化上来说，这种机制非常严格，并具有三重冗余，以确保这种复合物仅降解入侵DNA。”