大鼠脑微血管内皮细胞原代培养可用于：（1）血脑屏障的研究；（2）脑血管疾病的病理生理及分子生物学研究；（3）新药筛选；（4）脑微血管内皮细胞生理生化及药理学研究。实验方法原理
以大脑皮质为材料、酶消化及梯度离心分离脑微血管段并进行原代培养，成功地摸索出大鼠脑微血管内皮细胞分离和原代培养的方法，并获得纯度较高的脑微血管内皮细胞。
实验材料SD大鼠
试剂、试剂盒纤连蛋白Ⅳ型胶原明胶肝素钠碱性成纤维细胞生长因子青霉素链霉素NaHCO3牛血清白蛋白鼠尾胶葡聚糖DNA酶ID-Hanks＇液II型胶原酶
仪器、耗材低温离心机离心管移液枪
实验步骤
一、实验材料准备
1. 实验动物
每次实验采用10只2-3周龄SD大鼠，雌雄均可，体重40~60 g。
2. 试剂
纤连蛋白(fibronectin)、Ⅳ型胶原、鼠尾胶、葡聚糖(dextran，分子量100~200 kDa)和DNA酶I(DNase I)购自Sigma公司；D-Hanks＇液、10×PBS按配方自制；II型胶原酶购自Worthington公司；明胶、牛血清白蛋白(BSA)、HEPES购自Amresco公司；Percoll 购自Amersham Biosciences；DMEM(高糖)购自GIBCO/BRL公司；肝素钠、NaHCO3购自中国医药集团上海化学试剂公司；青、链霉素购自上海生工生物工程有限公司；胎牛血清(FBS)购自PAA Laboratories；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，胶原酶/分散酶(collagenase/dispase)购自Roche公司。
3. 仪器
低温离心机(Centrifuge 5810 R，购自Eppendorf；Himac CR 22F，购自Hitachi)。
4. 试剂配制
（1）1 mg/ml鼠尾胶(用0.2%乙酸配制)，1%明胶(用D-Hanks＇液配制)，1%II型胶原酶(用DMEM配制，用时稀释成0.1%的浓度)，1%胶原酶/分散酶(用DMEM配制，用时稀释成0.1%)，15%葡聚糖(用PBS配制)，20% BSA(用DMEM配制，调pH值至7.4后用0.45 μm滤膜过滤除菌，较难过滤)，DNase I(用冷PBS配制成2 U/μl)，以上试剂经0.22 μm滤膜过滤除菌后分装保存于-20℃。
（2）50%Percoll(配12 ml，需6 ml Percoll原液，0.67 ml 10×PBS，0.4 ml FBS，4.93 ml PBS)；DMEM培养液(含4000 mg/L D-葡萄糖，4 mmol/L L-谷氨酰胺，添加3.7 g/L NaHCO3，20 mmol/L HEPES，肝素钠 100 mg/L，青霉素 100 U/ml，链霉素 100 μg/ml)，pH值调至7.4，过滤除菌后分装保存于4 ℃，用时加入20% FBS及1 ng/ml bFGF。
二、培养皿预处理
1. 涂布3种不同的基质，培养前一天加入1 ml 1%明胶于35 mm塑料培养皿，置于37 ℃培养箱过夜，接种前用D-Hanks＇液漂洗2次。
2. 接种前4 h，加入鼠尾胶6~10 μg/cm2，在密闭的器皿里用氨气熏5~10 min后，置于室温1~2 h晾干后，用D-Hanks＇液漂洗2次。
3. 50 μl 0.1%纤连蛋白、50 μl 1 mg/ml Ⅳ 型胶原和400 μl双蒸水混合后，加入到每个培养皿中涂布均匀后吸出，可涂布10个培养皿，置于37 ℃培养箱1~2 h晾干后，用D-Hanks＇液漂洗2次。
三、 脑微血管段的分离与脑微血管内皮细胞原代培养
1. 大鼠颈椎脱臼处死后浸泡于75%乙醇中消毒3~5 min后断头置于玻璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑置于盛有冷D-Hanks＇液的玻璃培养皿中解剖去除小脑、间脑(包括海马)。
2. 随后将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以吸除软脑膜及脑膜大血管后置于新的含冷D-Hanks＇液玻璃培养皿中，用细解剖镊去除大脑白质、残余大血管和软脑膜，保留大脑皮质。
3. 用D-Hanks＇液漂洗3次后，加入1 ml DMEM培养液，用虹膜剪将其剪碎成1 mm3大小，加入0.1%Ⅱ型胶原酶(含30 U/ml DNase I，1 ml/大脑)混匀后37 ℃水浴消化1.5 h。
4. 离心(1 000 rpm，8 min，室温)，去上清液，加入20% BSA悬浮混匀后离心(1000 g，20 min，4 ℃)或加入15%葡聚糖悬浮混匀后离心(4 000 rpm，20 min，4 ℃)，去除中上层神经组织及大血管，保留底部沉淀。
5. 加入2 ml 0.1%胶原酶/分散酶(含20 U/ml DNase I)悬浮混匀后37 ℃水浴消化1 h，离心(1 000 rpm，8 min，室温)，去上清液，加入2 ml DMEM培养液悬浮后铺于经离心形成连续梯度的12 ml 50% Percoll(25 000 g，60 min，4 ℃)。
6. 离心(1 000 g，10 min，4 ℃)，靠近底部的红细胞层之上的白黄色的层面即为纯化的微血管段，吸出后用DMEM漂洗两次(离心1 000 rpm，5 min，室温)，去上清液。
7. 加入DMEM完全培养液(含20% FBS，100 μg/ml肝素钠)悬浮后接种于涂布基质的35 mm一次性塑料培养皿(1.5 ml/培养皿，可接种1个培养皿/大脑)，置于37 ℃、5%CO2培养箱内静置培养，12~24 h后换液，并加入1 ng/ml bFGF，随后隔天换液。
四、鉴定方法
形态学、Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测。
五、 结果
1. 细胞形态观察
接种当时可见由圆形的内皮细胞构成的呈单枝状或分枝状的脑微血管段，并可见散在的单细胞及组织碎片(见图1-1)；培养12~24 h后可见培养的细胞从贴壁的微血管段周围长出，细胞呈短梭形，区域性单层生长，经换液后微血管段的残余部分不断减少，成纤维细胞、周细胞等杂细胞含量较少；随着培养时间的延长，内皮细胞不断增殖，可见"漩涡"分布，大约5~7天细胞达到融合，短梭形的内皮细胞占90%以上，但可见少量周细胞等杂细胞生长于内皮细胞单层表面或细胞克隆间隙(结果未显示)。细胞生长过程见图1，细胞接种于纤连蛋白/Ⅳ型胶原涂布的培养皿。
2. 涂布不同基质的细胞生长情况
明胶及鼠尾胶涂布的培养皿微血管段贴壁时间较长，6 h时可见少量微血管段贴壁但无内皮细胞长出，12~24 h可见一些内皮细胞长出，24 h后脑微血管段完全贴壁并有较多的内皮细胞长出，两者无明显差异(见图2-1~4)；纤连蛋白/Ⅳ型胶原涂布的培养皿培养后6 h即可见微血管段贴壁并有一些内皮细胞长出，12~24 h内基本完全贴壁并有较多的内皮细胞长出(见图2-5,6)。
Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测可见培养的脑微血管内皮细胞的胞浆及核周有棕黄色着色，胞核呈空泡状结构；对照染色为阴性。
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注意事项
1. 自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。
2. 在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。
3. 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞盖住，以防止细菌落入。
4. 操作前要洗手，进入超净工作台后要用75％酒精或0.2％新洁尔灭擦拭手。试剂瓶口也要擦拭。
5. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼。金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，且冷却后才能夹取组织。吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。
6. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。
7. 不能用手触及消毒器皿的工作部分，工作台面上的用品摆放要布局合理。
8. 瓶子开口后要尽量保持45°斜位。
9. 吸溶液的吸管等不能混用。
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其他
一、实验讨论
我们采用两次酶消化、梯度离心分离得到脑微血管段，探索各种不同的培养条件，成功地进行了较纯的大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养，内皮细胞纯度可达90%以上，而且细胞得率较高，10只动物可培养8~10个35 mm一次性塑料培养皿，培养面积大约80~100 cm2，与国内的一些方法[3~5]相比，细胞得率有明显的提高。
由于新生鼠易于混有较多的杂细胞且大脑较小以及哺乳期大鼠优于超过1月龄的大鼠[9]，我们采用2~3- 12 - 丁香园细胞技术讨论版电子文集 大鼠脑微血管内皮细胞培养周龄哺乳期的SD大鼠作为培养材料。脑微血管内皮细胞原代培养的关键是首先分离获得纯度较高且活力好的脑微血管段。在解剖过程中仔细去除软脑膜、大血管及大脑白质收集大脑皮质，可减少成纤维细胞和平滑肌细胞的生长，对于提高内皮细胞的纯度具有重要意义。由于胶原酶对内皮细胞的损伤较小，我们采用0.1%Ⅱ型胶原酶消化剪碎后的大脑皮质分散组织，同组织匀浆法[3,10]相比，酶消化法可避免组织匀浆对内皮细胞的损伤，从而有利于提高细胞的活力。经胶原酶消化后采用20% BSA或15%葡聚糖离心可分离脑微血管段与神经组织及大血管，得到底层的脑微血管段，这种方法被广泛应用于脑微血管段的分离[5~9,11,12]，我们发现20% BSA较15%葡聚糖而言，其分离获得的脑微血管段数量更多，而且脑微血管段状态更好更易贴壁生长。由于周细胞是脑微血管内皮细胞原代培养中最常见的杂细胞，它会明显抑制内皮细胞的生长[7]，因此原代培养中应尽量减少周细胞的数量，我们采用两次酶消化方法[7]，控制两次酶消化的时间，用0.1%胶原酶/消化酶分散出内皮细胞外围的周细胞，最后采用一定浓度的连续梯度的Percoll分离以去除周细胞和红细胞得到较纯的脑微血管段。在酶消化过程中加入适量的DNA酶可分散消化过程中释放的DNA所引起的微血管段凝结块，有利于增加微血管段的得率。对于Percoll离心，我们尝试了3个浓度(33%、45%及50%)后发现，浓度越大，脑微血管段离靠近离心管底的红细胞及周细胞越远，分离效果也越好，因此采用50% Percoll效果最好，并且最好采用水平转头的低温离心机以提高离心效果。内皮细胞纯化的其他方法有机械刮除法、克隆培养法、FACS分类法[13]、Thy1.1免疫反应杀伤法[7,14]、采用血浆来源的胎牛血清[8]、磁珠结合法[10]等，但是我们发现机械刮除法和克隆培养法并不适合大鼠脑微血管内皮细胞的纯化，因为原代内皮细胞传代后状态不佳且易被杂细胞所抑制[7]，而后面几种方法比较昂贵不予推荐；血浆来源的胎牛血清不含PDGF，不促进杂细胞的生长，但是其较昂贵，可选择胎牛血清用于原代培养。
脑微血管内皮细胞的原代培养需要涂布明胶、鼠尾胶、纤连蛋白等基质以利于脑微血管段贴壁和内皮细胞的生长。我们尝试不同基质后发现其对脑微血管段的贴壁和内皮细胞的生长作用不同，纤连蛋白/IV型胶原优于鼠尾胶，而鼠尾胶比明胶好，而且接种密度的要求前者比后两者要低，后两者需要达到一定密度才有利于脑微血管段贴壁。另外我们发现内皮细胞不易生长于玻片上，而较易生长于塑料培养皿上，这与文献报道基本相符[8,14]。内皮细胞生长需要添加内皮细胞生长因子以促进内皮细胞的增殖抑制杂细胞的生长，我们采用bFGF可有效促进内皮细胞的生长，同时添加100 μg/ml肝素协同bFGF的作用并可抑制平滑肌细胞的生长[9]。同时为了保证内皮细胞的营养，并去除脑微血管段的残余碎片，我们采用20% FBS的血清浓度并隔天换液。
我们培养的脑微血管内皮细胞呈短梭形，区域性单层生长，随着培养时间的延长及内皮细胞的增殖，可见"漩涡状"分布，约5~7天后，各区域之间可逐渐融合，其形态和生长特点与大多数文献报道相似[6~9,11,12]。根据内皮细胞的短梭形的形态特点、Ⅷ因子相关抗原表达阳性可鉴定我们所培养的细胞确为脑微血管内皮细胞[3,5,8]。
我们的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养模型的建立，对于研究脑内皮的生理、生化及药理研究是一个较好的工具，同时可与星型胶质细胞共培养用于构建血脑屏障模型[1]。相信随着技术方法的不断改进，脑微血管内皮细胞体外培养的模型将逐渐接近于其在体特征，并被广泛应用于相关研究[1]。
参考文献
[1] Grant GA et al. News Physiol Sci, 1998, 13：287
[2] Panula P et al. Experientia, 1978, 34：95
[3] 王建民等。解剖学杂志，1998，21：495
[4] 许彦钢等。微循环技术杂志，1997，2：63
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[6] Kis B et al. Neuroreport, 2001, 12：4139
[7] Szabo CA et al. Neurobiology (Bp), 1997, 5：1
[8] Abbott NJ et al. J Cell Sci, 1992, 103：23
[9] Gordon EL et al. In Vitro Cell Dev Biol, 1991, 27A：312
[10] Diglio CA et al. Lab Invest, 1982, 46：554
[11] Rupnick MA et al. In Vitro Cell Dev Biol, 1988, 24：435
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[13] Scott PA et al. J Cell Sci, 1993, 105：269
[14] Domotor E et al. Neurochem Int, 1998, 33：473
