ELISA 作为经典的免疫检测方法，看起来很平常，然而真正做好它并不容易。有哪些秘笈，让武汉赛培生物的ELISA技术员告诉你：

1. 确定您的样本类型和试剂盒可以兼容

常见样本类型有血清，血浆，细胞培养上清，如果是厂家实验验证过的，可根据产品说明购买使用。【注意：血浆制备用到的抗凝剂有EDTA、柠檬酸盐、肝素等多种，相应的血浆性质存在差异，需单独确认兼容性】。

特殊样本，如尿液、胸腹水、脑脊液、灌洗液、泪液，组织匀浆液等，可能缺乏厂家数据支持，这并不是说试剂盒无法应用于这些样本，而是需要咨询有相关经验人士或自行实验验证可行性（如需进行掺入回收实验）。

2. 试剂盒检测范围需要匹配样本中标志物浓度

ELISA 试剂盒的定量检测范围需参考标准曲线，在标准曲线和浓度区间内属于线性范围，其中的值是可信和可定量的。浓度高于线性范围的样品要稀释到线性范围内来测量，而浓度低于线性范围的样品，其测量值不能用于计算浓度，只能用做参考。有一种常见的相关情况是：健康人样本中很多标志物的浓度偏低，测量值低于标准曲线值。

3. 样本收集有讲究

以血清为例，样本收集可参考试剂盒说明书，但需注意以下要点。样本尽量用无菌管收集，避免细菌的酶类和代谢产品对结果的影响。采集过程要避免溶血，因为红细胞溶解释放的活性物质可能会影响检测。保存过程中如有沉淀，应离心后取上清液。样本若不立即测定，建议按照每次使用量分装保存在-20℃，每次检测使用一管，即避免交叉污染和反复冻融，有能保证检测结果的平行可比性。

4.实验前要准备好相应试剂

5.提前将所有试剂平衡到室温环境，这个过程大致需半小时左右。洗液是浓缩液，如有结晶析出，需完全溶解后再进行稀释。A、B 两管显色底物在使用前15分钟按 1:1 配成混合液。为保证蛋白标准品溶液配制质量，蛋白标准品为冻干粉，重溶前需将管子离心，加入说明书指定的缓冲液，慢速在摇床上摇匀或颠倒混匀，至少 15 分钟，不建议用枪头吹打。溶解后如需保存，按每次使用量分装后根据说明书要求的温度保存。梯度稀释蛋白标准品时，建议用聚丙烯管（对蛋白吸附力很低），每步都要充分混匀且更换新枪头，确保梯度准确性。

5.仪器设备的准备也必不可少

相关设备包括移液器、洗板机/摇床和酶标仪。移液器的准确性对于ELISA实验结果的可靠性十分关键，需要确保定期校准维护。摇床的使用是为了让反应体系快速达到平衡，获得稳定、可重复的结果。不用摇床对实验通常的影响是，OD 值低，CV 大。酶标仪等设备使用前提前 15 分钟开机预热。

6. 预实验：通常预实验包括全部标准曲线和小量样本。

预实验有两个主要目的，一来是熟悉实验流程，发现可能忽略的问题；二来是测试样本和试剂盒是否匹配，一旦出现不匹配的情况，不至于浪费过多样本。另外是对样品中目的分析物的丰度作一下大致了解，以确定合适稀释度。

7. 剩余的试剂盒材料要妥善保存

标准品分装后按说明书要求的温度保存，这样可以避免污染，对要求冷冻保存的标准品还可以避免反复冻融；酶标板放回锡箔纸袋，加入干燥剂，封紧封口，4℃保存。忌未将酶标板完全平衡至室温，就放回锡箔纸袋，因为此时由于温度差，酶标板上会有水汽，不利于稳定保存。

8. 加样要快速准确，避免气泡

加样时间宜控制在15 分钟内。加样前要将样本混匀，特别是冻存后融化的样本（自然融化的血清等样本会有分层现象），应上下颠倒充分混匀，注意动作轻缓，避免产生气泡。如冻存融化后的样本有沉淀，可以再次离心。整个加样过程都要注意避免产生气泡。气泡会影响蛋白的相互结合，而影响反应进行。

9. 孵育时要保证温度均匀，防止挥发变干

孵育时压紧封口膜。多块板一起实验时，要平放各板，不要叠放，以免因温度不均造成漂移或边缘效应。

10. 洗板机的应用

使用洗板机，不但可以降低劳动强度，而且有利于保证ELISA 测试的稳定性。目前的全自动洗板机不但具有很多实用的洗涤动作，如底部冲洗，两点吸液，震动，交叉吸液；还可以根据需要调节冲洗压力，冲洗距离，冲洗时间等参数。通过优选这些动作和参数，能保证良好的洗涤效果。洗板机的性能对于结果准确性影响也很大，好的洗板机要保证洗板后的残留液尽可能的少，一般不超过 2μL，以洗涤后用人工拍板垫纸不湿为准。应定期检查抽吸针头是否堵塞。洗液如果含有吐温，应随用随配。

11. 手动洗板的操作指南

加洗液要快速，没有多道移液器可以使用洗瓶。洗液应新鲜配制，以免被其他试剂污染，或染菌。加好洗液后浸泡30s-1min。甩板倒液要迅速干脆。倒液后在吸水纸上拍板，选用无粉尘和碎屑的优质吸水纸。需要用力拍板，使孔内没有可见液体挂壁；但也不能太重，不能让样品干太久。酶标板拍干后立即做后续的加液。

12. 显色反应的关键点

ELISA 实验是个酶促底物显色反应，随时间增加，显色变深，所以选择*佳时间终止反应是得到准确的标准的曲线和样本浓度的重要因素。终止过程要完全。使用的TMB 底物时完全终止点是黄色，不会有任何程度的蓝色或绿色，终止过程中必要时可以震荡 96 孔板，或用枪头抽吸混匀（终止液含强酸，避免腐蚀）。

13. 数据分析

按照说明书推荐的数据分析方法做曲线拟合及分析。说明书中的标准曲线是在厂商的实验室中，由非常有经验的操作人员得到的结果。客户的标准曲线和说明书中的标准曲线可能存在不同，但不等于不好。通常判断标准曲线合格的标准为：：背景OD 值 <0.2；点 OD 值>1.0；相关系数 R2 接近或等于 1。只要满足这些条件的标准曲线都是可以使用的。

结语

当您了解并掌握了ELISA 实验的这些独门秘笈，离做出*棒的 ELISA 就只有一步之遥了，接下来不妨到武汉赛培生物ELISA 试剂盒中挑选一款适合您的产品，去获得稳定可靠的实验数据吧。

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