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提供者：15453842281 发布时间：2018/09/27 阅读次数：108次
本标准适用于食品中双歧杆菌的鉴定。
一、设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
a）恒温培养箱：36℃±1℃；
b）气相色谱仪配FID检测器；
c）冰箱：2℃～5℃；
d）天平：感量0.1g；
e）无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm；
f）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器（200μL~1000μL）及配套吸头；
g）无菌锥形瓶：500mL、250mL。
二、培养基和试剂
1双歧杆菌培养基：见附录A中的A.1。
2PYG液体培养基：见附录A中的A.2。
3甲醇：分析纯。
4三氯甲烷：分析纯。
5硫酸：分析纯（体积比）。
6冰乙酸：分析纯（体积比）。
7乳酸：分析纯。
8乙酸标准溶液：吸取分析纯冰乙酸5.7mL，移入100mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附录B，此溶液浓度约为1mol/L。
3.9乙酸标准使用液：将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。
3.10乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4mL，移入100mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附录B，此溶液浓度约为1mol/L。
3.11乳酸标准使用液：将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。
三、操作步骤
1样品制备
1.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。
1.2以无菌操作称取25g（mL）样品，置于装有225mL生理盐水的灭菌锥形瓶内，制成1:10的样品匀
液。
2稀释及涂布培养步骤
2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1.0mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的
无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制
成1:100的样品匀液。
2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按5.2.1操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一
次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。
2.3根据待鉴定菌种的活菌数，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL稀释液，用L棒
在双歧杆菌琼脂平板进行表面涂布,每个稀释度作两个平皿。置36℃±1℃温箱内培养48h±2h，培养后
选取单个菌落进行纯培养。
3纯培养
挑取3个或以上的菌落接种于双歧杆菌琼脂平板，厌氧，36℃±1℃培养48h。
4镜检及生化鉴定
4.1涂片镜检
双歧杆菌菌体为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢，无动力，菌体形态多样，呈短杆状、纤细杆状或
球形，可形成各种分支或分叉形态。
4.2生化鉴定
过氧化氢酶试验为阴性。选取纯培养平板上的三个单个菌落，分别进行生化反应检测，不同双歧杆菌
菌种主要生化反应见附录B。
5有机酸代谢产物测定
气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物,见附录C。
6报告
根据镜检及生化鉴定的结果（5.4）、双歧杆菌的有机酸代谢产物乙酸与乳酸微摩尔之比大于1（5.5），
报告双歧杆菌属的种名。
培养基
A.1双歧杆菌琼脂培养基
A.1.1成分
蛋白胨15.0g
酵母浸膏2.0g
葡萄糖20.0g
可溶性淀粉0.5g
氯化钠5.0g
西红柿浸出液400.0mL
吐温801.0mL
肝粉0.3g
琼脂粉15.0g～20.0g
加蒸馏水至1000.0mL
A.1.2制法
A.1.2.1半胱氨酸盐溶液
称取半胱氨酸0.5g，加入1.0mL盐酸，使半胱氨酸全部溶解，配制成半胱氨酸盐溶液。
A.1.2.2西红柿浸出液
将新鲜的西红柿洗净后称重切碎，加等量的蒸馏水在100℃水浴中加热，搅拌90min，然后用纱布过滤，校正pH7.0，将浸出液分装后，121℃高压灭菌15min～20min。
A.1.2.3培养基
将A.1.1所有成分加入蒸馏水中，加热溶解,然后加入半胱氨酸盐溶液，校正pH6.8±0.2。分装后121℃高压灭菌15min～20min。临用时加热熔化琼脂，冷至50℃时使用。
A.2PYG液体培养基
A.2.1成分
蛋白胨10.0g
葡萄糖2.5g
酵母粉5.0g
半胱氨酸-HCl0.25g
盐溶液20.0mL
维生素K1溶液0.5mL
氯化血红素溶液5mg/mL2.5mL
加蒸馏水至500.0mL
A.2.2制法
A.2.2.1盐溶液
称取无水氯化钙0.2g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾1.0g，磷酸二氢钾1.0g，碳酸氢钠10.0g，氯化钠2.0g，加蒸馏水至1000mL。
A.2.2.2氯化血红素溶液（5mg/mL）
称取氯化血红素0.5g溶于1mol/L氢氧化钠1.0mL中，加蒸馏水至1000mL，121℃高压灭菌15min～20min。
A.2.2.3维生素K1溶液
称取维生素K11.0g，加无水乙醇99mL，过滤除菌，冷藏保存。
A.2.2.4培养基
除氯化血红素溶液和维生素K1溶液外，A.2.1其余成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正pH6.0，加入中性红溶液。分装后121℃高压灭菌15min～20min。临用时加热熔化琼脂，加入氯化血红素溶液和维生素K1溶液，冷至50℃使用。
四、 鉴定程序
双歧杆菌鉴定程序见图1。
