整装培养细胞生物膜系统的标本制备及观察实验_技术交流_仪器仪表技术文献

提供者:15453838811  发布时间:2018/12/19  阅读次数:71次  

细胞生物膜系统是指由细胞膜、细胞核膜以及内质网、高尔基体、线粒体等有膜围绕而成的细胞器,在结构和功能上是紧密联系的统一整体,由于细胞膜、核膜以及内质网、高尔基体、线粒体等由膜围绕而成的细胞器都涉及到细胞膜或细胞器膜,所以通常称此系统为生物膜系统。
实验方法原理高锰酸钾固定液能除掉细胞内的蛋白质成份,而保留膜的脂类成分,其结果,细胞骨架和细胞内可溶性蛋白质等被去除,增加了标本的透明度,同时内质网、线粒体、高尔基体、溶酶体等生物膜系统被完整地保存下来。高锰酸钾固定剂在固定标本的过程中,能形成二氧化锰,可在细胞的各种膜结构的脂类亲水端形成微细的沉淀,结果标本不需染色,即能在相差显微镜和透射电镜下清晰地显示细胞生物膜系统全貌。
实验材料肾上皮细胞
试剂、试剂盒高锰酸钾秋水仙素PBSFormvar液
仪器、耗材显微镜相差显微镜透射电子显微镜镍网载玻片盖玻片培养皿CO2培养箱
实验步骤
一、高锰酸钾固定法显示用药(秋水仙素处理)前后CV-1细胞生物膜系统光镜标本的制备及观察。
1. 取无菌盖玻片,分别放入二个直径5 cm 的培养皿中,接种CV-1细胞,加3 ml 培养基。
2. 加盖做好标记,移入CO2培养箱培养24小时。其中一个培养皿在终止培养前4小时,加入10 μg/ml 秋水仙素0.3 ml。
3. 在倒置显微镜下观察选定长有铺展良好细胞的盖玻片,终止培养,倒掉培养液。
4. PBS液冲洗盖玻片二次,清除细胞表面的培养基和杂质。
5. 取出盖玻片,将长有铺展良好细胞的盖玻片,细胞面朝上放在载片上。
6. 滴新配制的高锰酸钾固定剂于盖玻片上,固定10分钟。
7. 蒸馏水轻轻地冲洗标本的细胞面5次,去除残留固定液。
8. 取下盖玻片,用滤纸吸干多余水份,滴1滴PBS液于载玻片上,将盖玻片附有细胞面朝下,装片。
二、高锰酸钾固定液显示用药(秋水仙素处理)前后CV-1细胞生物膜系统电镜标本的制备及观察。
1. 用0.5%Formvar液制做支持膜。
2. 将覆有Formvar膜的镍网经紫外线灯灭菌后,放入直径5 cm 的无菌培养皿中,加培养基3ml。
3. 接种CV-1细胞于铺有支持膜的镍网上,一组是不经药物处理的作为对照组,另一组是经10 μg/ml 秋水仙素处理的作为实验组。
4. 实验组的培养细胞在终止培养前4小时加入10 μg/ml 秋水仙素0.3 ml,放入CO2培养箱中进行细胞培养。
5. 待细胞铺展开后,取出镍网,用乳头吸管滴1滴高锰酸钾固定液于镍网上,固定细胞10分钟。
6. 经上升梯度乙醇系列脱水:30%→50%→70%→85%→90%→95%→100%,每次脱水3分钟。
7. 待镍网晾干后,在透射电子显微镜下(75 KV 电压)进行观察。
三、结果
1. 在光镜下和透射电子显微镜下,内质网呈网状铺展于整个细胞质内。
2. 细胞核周围的内质网形成较稠密三维结构,远离细胞核周围的内质网则呈松散的网状伸展至细胞边缘。
3. 在电镜下可见内质网由细管和扁囊构成。除内质网外,还可看到粗大的呈条索状的线粒体,也可观察到高尔基器和溶酶体等膜性结构。
4. CV-1细胞经秋水仙素处理后,其内质网向细胞核周围聚集,细胞边缘区域不再观察到内质网。
5. 秋水仙素破坏微管结构,因此,内质网的分布可能与微管的存在有密切关系。

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