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提供者：15453839241 发布时间：2018/12/12 阅读次数：77次
实验操作：
准备材料和试剂：
1、配制2×培养基：1 g培养基粉末，0.2 g碳酸氢钠，加入去离子水，定容到50 mL。
2、将培养基经0.2 μm滤膜过滤除菌。
3、加入目标细胞所需培养基的其他成分。例如：用RPMI 1640培养基培养CMT 167细胞需要加入10% FBS，1% 青霉素/链霉素。使用之前将培养基放在37°C水浴锅。
4、配制1×培养基，依照目标细胞生长所需培养基配制。
5、配制1%琼脂：1 g琼脂加入到100 mL去离子水中。
6、配制0.6%琼脂：0.6 g琼脂加入到100 mL去离子水中。
7、将配好的琼脂经高温高压灭菌，灭菌后可放在4°C保存，使用前加热至完全溶解。
8、配制氯化硝基四氮唑蓝试剂：1 mg/mL氯化硝基四氮唑蓝加入到1×PBS中。
铺下胶：
1、将熔化的1%琼脂溶液和预热的2×培养基放入装满热水（42°C）的桶（或水浴锅）中，在热水里放一个50 mL的锥形管。将桶放入超净台内。
2、6孔板中的每个孔需要加入1.5 mL混合的琼脂和培养基，为保证足够的量，一个6孔板准备12 mL。
3、首先加入6 mL的培养液到50 mL的锥形管，再加入6 mL的1%琼脂溶液。将锥形管多次翻转混匀，每个孔中迅速加入1.5 mL混合液，加混合液时不能产生气泡。
4、室温静置30 min，待下胶凝固。
铺上胶：
1、收获的细胞用胰蛋白酶消化，用培养基以1:5的比例稀释（如1 mL胰蛋白酶，加4 mL培养基），放入15 mL锥形管。
2、细胞计数：以每孔5000个细胞作为起始，并根据需要进行调整。
3、细胞悬浮液的体积需要1.5 mL。一个6孔板准备12 mL细胞悬液。
4、将熔化的0.6%琼脂溶液放入装有热水（42°C）的桶中，在热水里放一个50 mL的锥形管。将桶放入超净台内。
5、以1:1的比例混合0.6%琼脂溶液和细胞悬液，吸取6 mL细胞悬浮液到50 mL锥形管，再加入6 mL的0.6%琼脂溶液。混匀后迅速加入6孔板中，每孔1.5 ml。小心避免产生气泡。
6、室温静置30 min，待上胶凝固后放入细胞培养箱。
7、足够的菌落形成所需的时间因每个细胞系而异，通常为21天左右。每星期加两次100 g的培养基以防止干燥。
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