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提供者：15453838811 发布时间：2018/12/12 阅读次数：71次
直接从生物体内获取组织细胞进行的首次培养称为原代细胞培养。原代培养是建立各种细胞系的第一步，是从事培养工作的人员应熟悉和掌握的最基本的技术。根据培养方法不同分为组织块培养法和单层细胞培养法。
实验材料 小鼠
试剂、试剂盒 DMEMDMEM胰酶PBS
仪器、耗材 饭盒纱布小剪子小镊子大镊子大烧杯平皿研磨玻片滤网离心管6 孔培养板吸管移液管手套微量加样器
实验步骤
一、实验步骤
1. 将小鼠断颈致死，置 75%酒精泡2-3 秒钟，取肝脏，置于盛有 PBS 的平皿中。
2. 剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有 PBS 液的平皿中。
3. 用手术剪将脏器剪成小块(大小约 1mm2)，玻片研磨，转到离心管，离心(1000 rpm，5 min)。
4. 视组织或细胞量加额加入5-6 倍(3-5 ml)胰酶，37℃中消化 20 分钟，每隔 5 分钟振荡一次，或用吸 管吹打一次，使细胞分离。
5. 加入3-5 ml 含血清的培养液以中止胰酶消化作用。
6. 用100 目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。
7. 再次离心5 min，弃上清液。
8. 加入无血清培养液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9. 加入含血清的培养液 l-2 ml (视细胞量)，血球计数板计数。
10. 将细胞调整到5×105/ml 左右，转移至6 孔培养板中，37℃下培养。
收起
注意事项
1. 自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。
2. 在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。
3. 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞盖住，以防止细菌落入。
4. 操作前要洗手，进入超净工作台后要用75％酒精或0.2％新洁尔灭擦拭手。试剂瓶口也要擦拭。
5. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼。金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，且冷却后才能夹取组织。吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。
6. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。
7. 不能用手触及消毒器皿的工作部分，工作台面上的用品摆放要布局合理。
8. 瓶子开口后要尽量保持45°斜位。
9. 吸溶液的吸管等不能混用。
