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提供者：15453839241 发布时间：2018/12/10 阅读次数：59次
一、实验目的与要求
了解涂布分离和平板划线法从食物中分离食源性微生物的原理和方法，并熟练掌握该操作方法。
二、实验原理
微生物是蛋白酶的最佳来源，与动物和植物相比，微生物作为蛋白酶的来源具有更多生理生化上的优越性。微生物来源的蛋白酶都是胞外酶，易于分离纯化，更重要的是微生物易于培养和发酵，有广泛的生物化学多样性和遗传操作的感受性。
通过稀释涂布法或划线分离法在选择性平板上可以对产蛋白酶菌株进行分离。稀释涂布平板法是一种将菌体按比例制备成若干个稀释度，再分别经涂棒涂布培养而进行微生物分离纯化的方法；平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的“纯种”。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
根据透明圈的大小来筛选目的菌株，透明圈越大的菌具有较强的产酶能力。对分离到的菌株进行纯化，得到高产蛋白酶菌株。
三、试验材料
1、材料与试剂
豆腐乳：市购豆腐乳
2、主要仪器与设备
无菌操作箱、恒温水浴锅、生化培养箱、高压灭菌锅、振荡培养箱
四、实验步骤与方法
1、培养基的制备
可溶性淀粉1%、酵母膏0.5%、酪蛋白1%、KH2PO40.1%、MgSO40.02%、琼脂2.0%,pH值为中性.
配制方法:称取酪蛋白1.0g,先用少量2%NaOH润湿,玻棒搅动,再加适量的蒸馏水,在沸水浴中加热并搅拌,至完全溶解,补足水量至100mL,加入其他成分,调整pH,灭菌备用。
2、菌株纯化分离(涂布法和划线法每组选一种方法进行操作)
（1）稀释法分离:采用无菌水,10倍梯度稀释豆腐乳的菌悬液到10^8，吸取10^6到10^8梯度的菌悬液各1mL，注入初筛培养基平板中,每个梯度做2个平行平板,涂布均匀。将涂布后的平板置于28℃的恒温培养箱中培养48h。
(2)划线分离:对豆腐乳菌悬液(取1mL豆腐乳汁加入10mL无菌水制成)划线分离,制作两个划线分离平板,将平板置于28℃的恒温培养箱中培养48h。
