工欲善其事，必先利其器
——高效基因筛选与精准蛋白检测
高效基因筛选与精准蛋白检测是近年来备受瞩目的创新前沿技术，在探索疾病相关基因及其表达的蛋白在特定生理、病理、发育等过程中所起的功能时发挥重要作用，正成为诊断与治疗血液病、肿瘤、遗传病等疾病的有利工具。
Sanger矩阵型CRISPR文库——让基因筛选更高效
2012年，基因编辑技术CRISPR横空出世，以其简易、高效的特征迅速成为该领域的新宠。CRISPR技术以引导RNA（gRNA）识别靶序列，以单个蛋白Cas9切断DNA双链，最终实现基因的完全沉默。基于这一无与伦比的特征，CRISPR先驱Zhang Feng团队等迅速将其应用于全基因功能完全沉默的筛选。经过几年的高速发展，基于CRISPR的全基因筛选有效减少筛选中的脱靶现象，避免关键基因的遗漏，已隐隐有超越shRNA模式的态势。最初，科学家使用的是集合型文库，集合型全基因文库的出现，帮助人们实现了对全基因水平的功能完全缺失的高效筛选。科学家们利用CRISPR/Cas9集合型文库筛选发现黑色素瘤耐药关键基因1，实现肿瘤生长与迁移的在体筛选2，甚至发现病毒感染人类的关键基因3。
2016年科技界创新"奥斯卡奖"R&D 100大奖授予了Sanger矩阵型CRISPR文库。由Merck公司与Sanger研究所联合推出的这款CRISPR矩阵型文库，突破"筛选方式限于细胞分群实验、依赖低MOI慢病毒介导、数据分析必须通过二代测序"等CRISPR集合型文库的局限性，为科学家们带来了技术革新的福音：筛选策略不再受限于正向或反向筛选，而是可以使用各类细胞学实验作为数据读出结果。科学家们争先巩后利用CRISPR/Cas9矩阵型文库实现功能基因的大规模敲除4，构建GPI调控蛋白的全基因筛选模型5，大大加速了科学研究发现流程。
看得见的蛋白互作新技术Duolink? PLA?——让蛋白检测更精准
肿瘤、高血压、糖尿病，人类面临着与疾病赛跑的巨大压力。如何利用蛋白生物标志物加速对疾病致病机理的探究过程，精准诊断有效预后是科学家与医学工作者们研究的重点与难点。传统的蛋白研究方法如Co-IP、Western blot、ELISA、IF等因检测灵敏度低、假阳性高、适用样本范围窄等原因而呈现出极大的局限性。
看得见的蛋白互作新技术Duolink® PLA® 的出现给科研工作者带来更大的可能性。Duolink® PLA®可实现单分子级别的蛋白互作检测，特异性放大信号1000倍，实现了可视化原位定量检测细胞生理水平的微量蛋白的微弱互作和修饰。目前，Duolink® PLA® 技术已在肿瘤学、神经生物学、免疫学、病毒学、表观遗传学、生殖发育、组织病理学、心血管、代谢等研究领域进行了广泛报道。
应用1：Duolink® PLA®在微量细胞中的微弱蛋白互作检测，解决Co-IP技术无法实现的应用
在神经生物学研究中，很多时候研究的起始材料包括细胞、组织等非常微量，同时相互作用的蛋白也很微弱，超出了传统方法如CO-IP的检测灵敏度。在神经生物学研究中，DYX1C1是阅读障碍的易感基因，与神经元迁移有关，但是并不清楚它们之间的功能与相关性。
下图显示原代大鼠胚胎海马神经元使用雌二醇培养48h，PLA检测雌激素受体ERs/DYX1C1在神经突触中的相互作用（A和D为雌二醇（E2）刺激组，B和E为未刺激组，C和F为无抗体阴性对照），每一个红点代表ERs/DYX1C1相互作用的复合物，蓝色代表 Hoechst染细胞核，绿色代表Actin蛋白。作者使用传统Co-IP方法并没有在胚胎神经元中检测到相互作用的复合物。通过PLA技术，对DYX1C1的功能有新的理解，发现了神经元迁移，阅读障碍与雌性激素信号通路的联系，从而影响脑发育，调节认知功能。
应用2：Duolink® PLA®在病理组织中蛋白相互作用的原位检测，解决IHC无法实现的应用
在肿瘤的靶向治疗过程中，BRAF是非常重要的药物靶点，很多肿瘤都存在BRAF(V600)的突变，很多药物都是针对这个位点，但是逐渐增加的药物抗性让大家迫切希望能够进一步发现新的药物靶标，和传统药物联合治疗，进一步提高药物治疗效果。
下图是发表在Nature上的文章，研究者从药物产生抗性的机理出发，针对抗性相关的信号通路中共同的复合物eIF4F，开发了Duolink® PLA®原位技术在细胞以及临床病人的病理组织样本进行大量的检测的方法。图中显示与anti-BRAF治疗前的肿瘤相比，eIF4F复合物的形成比率在免疫应答的肿瘤中降低，在抗药性转移的肿瘤中复合物形成比率升高，图中每个棕色的点状信号代表一个相互作用复合体。因此eIF4F能够作为先天（innate）和获得性（acquired）抗性的指示器，也能作为抗肿瘤治疗的靶标。通过封闭eIF4E–eIF4G相互作用或靶向eIF4A，能够抑制eIF4F复合物的形成，从而协同抑制BRAF(V600)，消除肿瘤细胞。
PLA技术作为病理组织学研究的第二代新技术，在蛋白相互作用研究中具有高分辨率及精确性，是传统IHC实验无法实现的，能够建立高质量建立病样组织标本库。
应用3．Duolink® PLA®在单细胞水平分析组蛋白的修饰，解决ChIP研究中无法实现结果的应用
表观遗传学是当前众多研究中非常热点的方向，而ChIP又是表观遗传学中最重要的技术之一，能很好地理解组蛋白修饰在基因调控中的作用，但ChIP无法在单细胞水平上进行研究。
下图发表在Nature上的文章，将PLA技术与原位杂交（ISH）技术联合起来开发出新的ISH-PLA技术，能够在石蜡切片的组织样本中，对特定类型单细胞中的特定基因位点的组蛋白修饰进行可视化研究，图中箭头表示在人颈动脉和脑组织中的组蛋白修饰的PLA信号。研究发现在人和小鼠的组织中MYH11位点的H3K4me2被限制在平滑肌细胞中，ISH-PLA 能够准确、特异性地检测人和小鼠组织中单个细胞的特定基因位点的组蛋白修饰。该研究第一次在复杂的多种类型细胞存在的完整组织样本中，在内源性水平鉴定了特定细胞和基因位点组蛋白修饰，显示在体内SMC细胞中MYH11基因H3K4me2独特和重要的表观特征，表明PLA技术可以很方便地适用于单细胞水平组蛋白修饰和多个基因位点的检测。
1. Ophir Shalem, Neville E. Sanjana, Ella Hartenian et al. Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Science. 2014 January 3; 343(6166): 84–87.
2. Sidi Chen, Neville E. Sanjana et al. Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis, 2015, Cell 160, 1246–1260.
3. Rong Zhang, Jonathan J. Miner, et al., A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature. 2016 July 7; 535(7610): 164–168.
4. Tobias Schmidt, Jonathan L. Schmid-Burgk & Veit Hornung, Synthesis of an arrayed sgRNA library targeting the human genome. DOI: 10.1038/srep14987.
5. Unpublished data provided by courtesy of Emmanouil Metzakopian, Wellcome Trust Sanger Institute.
6. Mellberg S, Dimberg A, Bahram F, et al. Transcriptional profiling reveals a critical role for tyrosine phosphatase VE-PTP in regulation of VEGFR2 activity and endothelial cell morphogenesis[J]. Faseb Journal, 2009, 23(5):1490-1502.
7. Massinen S, Tammimies K P I. Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.[J]. Human Molecular Genetics,2009, 18(15):2802.
8. Boussemart L, Malkamahieu H, Girault I, et al. eIF4F is a nexus of resistance to anti-BRAF and anti-MEK cancer therapies.[J]. Nature, 2014, 513(7516):105.
9. Mellberg S, Dimberg A, Bahram F, et al. Transcriptional profiling reveals a critical role for tyrosine phosphatase VE-PTP in regulation of VEGFR2 activity and endothelial cell morphogenesis[J]. Faseb Journal, 2009, 23(5):1490-1502.
10. Gomez D, Shankman L S, Nguyen A T, et al. Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections[J]. Nature Methods, 2013, 10(2):171.
11. Leuchowius KJ; Jarvius M; etc. High content screening for inhibitors of protein interactions and post-translational modifications in primary cells by proximity ligation[J]. Molecular & cellular proteomics : MCP, 2010, 9(1):178.
